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林 珊,郭三平,江心怡,莫红梅
深圳市罗湖医院集团医学检验中心，广东深圳 518000
传染性单核细胞增多症(IM)是常见急性传染病，主要是由于EB病毒(EBV)感染造成的，儿童为高发人群，导致发热、咽峡炎、淋巴结肿大等[1]。该病病程具有自限性，一般预后良好，但是其临床表现变化多样，且涉及多个系统，早期易误诊或漏诊，若治疗不及时易导致继发其他恶性疾病或严重并发症[2]。近年的免疫学研究显示，EBV能逃避免疫系统识别，成功侵入B淋巴细胞，造成外周血淋巴细胞计数及形态的改变，因此血细胞形态学检测对临床诊治IM具有重要意义[3]。随着生物学技术发展，EBV-DNA检测也被用于IM的诊断，其负荷量能够反映EBV复制水平，具有较高的特异性[4]。Toll样受体(TLR)是一种模式识别受体，在EBV感染早期能够识别病毒蛋白，在机体免疫应答中发挥一定作用，TLR7还可识别单链RNA病毒，诱导抗病毒反应或炎性反应[5]。基于此，本研究对IM患儿外周血细胞形态学检测结果、TLR7 mRNA及EBV-DNA水平进行分析，探讨3项指标联合检测在IM中的诊断价值，现报道如下。
1.1一般资料 选择2020年1月至2021年10月来本院就诊的IM患儿119例作为IM组，纳入标准：(1)符合IM诊断标准[6]；
(2)均为初诊病例；
(3)能配合研究。排除标准：(1)伴有恶性肿瘤患儿；
(2)患有严重血液疾病患儿；
(3)伴有严重心、肺、肝功能障碍患儿；
(4)存在精神疾病患儿；
(5)存在免疫缺陷患儿；
(6)发育迟缓或先天畸形患儿。选择同期来本院体检的健康儿童50例作为对照组。两组患儿的一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性，见表1。本研究经本院医学伦理委员会同意，所有研究对象家属均知情同意。
表1 两组患儿一般资料比较(n/n或
1.2方法
1.2.1外周血细胞形态学检测 所有受试者入院时采集外周静脉血2 mL，采用EDTA-K2抗凝，进行血涂片，瑞氏-姬萨姆染液(珠海贝索公司)染色，待血片自然干燥后，油镜镜检。由具备血液细胞学检测资质的检验师进行阅片，观察血细胞形态，进行淋巴细胞计数，并在显微镜下计数100个白细胞，得到异型淋巴细胞比值。阳性标准：异型淋巴细胞比值>10%。
1.2.2外周血EBV-DNA载量检测 所有受试者入院时采集外周静脉血2 mL，置于EDTA-K2抗凝管中，采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)仪检测EBV-DNA载量。PCR扩增条件：50 ℃静止2 min，1个循环(进行UNG酶反应)；
94 ℃预变性5 min，1个循环(进行Tap酶活化)；
再94 ℃变性15 s，57 ℃变性31 s，共10个循环，最后94 ℃变性30 s；
55 ℃变性45 s，共30个循环。按照试剂盒说明书，以≥1×103copy/mL为阳性。
1.2.3TLR7 mRNA检测 所有受试者入院时采集外周静脉全血2 mL，常规抗凝后，将外周血单个核细胞(PBMC)进行分离备用。采用RT-qPCR进行TLR7 mRNA检测。采用Trizol试剂盒提取总RNA，并反转录为cDNA。RT-qPCR引物序列：正向，5′-ATTGTGAAGTCCAGACTCTTTGTC-3′；
反向，5′-CCTGCTGCCAGTGGCTGACCAGT-3′。体系为20.0 μL：10.0 μL TaqⅡ qPCR，0.4 μL 10 μmol/L PCR上游引物，0.4 μL 10 μmol/L PCR下游引物，2.0 μL cDNA模板和7.2 μL去酶水。RT-qPCR反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性20 s，52 ℃退火10 s，72 ℃延伸2 min，共36个循环。TLR7 mRNA表达水平以2-ΔΔCt方法计算。
1.3观察指标 (1)收集所有受试者的一般资料；
(2)比较IM组与对照组的外周血细胞形态学检测结果、TLR7 mRNA表达水平及EBV-DNA载量；
(3)比较IM组中不同EBV-DNA载量患儿的外周血细胞形态学检测结果及TLR7 mRNA表达水平；
(4)分析外周血细胞形态学检测结果、TLR7 mRNA表达水平与EBV-DNA载量的相关性；
(5)分析异型淋巴细胞比值、TLR7 mRNA表达水平及EBV-DNA载量对IM的诊断价值。
2.1两组外周血细胞形态学检测结果、EBV-DNA载量及TLR7 mRNA表达水平比较 IM组的淋巴细胞计数、异型淋巴细胞比值、EBV-DNA载量及TLR7 mRNA表达水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。
表2 两组外周血细胞形态学检测结果、EBV-DNA载量及TLR7 mRNA表达水平比较
2.2IM组中不同EBV-DNA载量患儿的外周血细胞形态学检测结果及TLR7 mRNA表达水平比较 以IM组患儿的EBV-DNA中位水平7.18×103copy/mL为界值，将≥7.18×103copy/mL的患儿纳入高载量组(60例)，<7.18×103copy/mL的患儿纳入低载量组(59例)。两组淋巴细胞计数比较，差异无统计学意义(P>0.05)，高载量组的异型淋巴细胞比值及TLR7 mRNA表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。
表3 IM组中不同EBV-DNA载量患儿的外周血细胞形态学检测结果及TLR7 mRNA表达水平比较
2.3外周血细胞形态学检测结果、TLR7 mRNA表达水平与EBV-DNA载量的相关性 淋巴细胞计数与EBV-DNA载量无明显相关性(P>0.05)，异型淋巴细胞比值及TLR7 mRNA表达水平与EBV-DNA载量呈正相关(P<0.05)，见表4。
表4 外周血细胞形态学检测结果、TLR7 mRNA表达水平与EBV-DNA载量的相关性
2.4异型淋巴细胞比值、EBV-DNA载量及TLR7 mRNA对IM的诊断价值 ROC曲线分析发现，3项指标联合诊断IM的曲线下面积(AUC)为0.952，高于单一的异型淋巴细胞比值、EBV-DNA载量及TLR7 mRNA的AUC(0.863、0.878、0.792)，见图1、表5。
图1 异型淋巴细胞比值、EBV-DNA载量及TLR7 mRNA诊断IM的ROC曲线
表5 异型淋巴细胞比值、EBV-DNA载量及TLR7 mRNA诊断IM的效能分析
IM是由EBV感染引起的急性增生性传染病，传播途径为唾液及血液。EBV感染可引起全身性免疫异常，累及多个器官，同时还能逃避机体的免疫反应，在人体淋巴组织中潜伏，使患者长期携带病毒[7-8]。研究表明我国IM多见于儿童，小于12岁儿童的发病率可达60%，多数患儿起病时症状轻微，无特异性临床表现，在临床诊断中极易出现漏诊或误诊情况，而治疗不及时可能引起其他严重并发症，进而威胁患儿生命，因此早期的准确诊断十分关键[9]。而目前的诊断方式仍是以实验室检查为主，但每种检查方法都有方法学的限制，联合检查是如今临床对疾病进行诊断的发展趋势。
研究表明当EBV入侵人体时，B淋巴细胞受体会与其结合，随后病毒增殖、复制，进一步激活抑制性T淋巴细胞的增殖、自身转化，由于细胞毒性效应，使异常增殖的T淋巴细胞发生形态学的改变，形成异型淋巴细胞，该类细胞一般分为幼稚型、不规则型、空泡型3种形态[10-11]。外周血细胞形态学检测具有临床实用性，有报道指出EBV感染患儿外周血异型淋巴细胞计数明显升高[12]。本研究中，IM组的淋巴细胞计数、异型淋巴细胞比值均高于对照组，这与前人研究具有一致性[12]。研究表明，异型淋巴细胞普遍出现在IM发病后3 d，于第1周渐渐加多，其比值能够达10%，在第2～3周最多可达40%，因此外周血细胞形态学检测有利于IM早期诊断[13]。还有研究认为异型淋巴细胞在其他疾病，如腺病毒、肝炎病毒、巨细胞病毒等导致的感染性疾病中也存在增多现象，因此还需联合其他手段辅助IM的诊断[14]。
近年来RT-qPCR检测EBV-DNA成为检测EBV感染的重要手段，该方式能够有效扩增，并对每个循环中的PCR产物进行实时监测，可以将病毒的拷贝数准确检测出来，并能反映EBV感染，具有较高的特异性及准确性，且重复性好、操作简便[15]。黄璐[16]研究表明EBV-DNA载量在诊断IM中具有较高临床应用价值。本研究中，IM组的EBV-DNA载量高于对照组，提示IM患儿感染后，EBV-DNA水平显著升高。研究表明，对于临床症状不典型、血清学不能诊断的疑似IM患儿进行EBV-DNA检测，能够对发热初期的IM患儿早期诊断，避免抗菌药物的滥用及并发症的发生[17]。同时本研究发现，高载量组的异型淋巴细胞比值高于低载量组，异型淋巴细胞比值与EBV-DNA载量呈正相关，这提示患儿体内EBV-DNA载量与异型淋巴细胞比值有关。研究表明，EBV-DNA载量与IM患儿病情严重程度有关，其水平能够反映病毒复制能力及患儿免疫清除能力，病毒载量越高，患儿病情越严重，机体免疫功能越差，异型淋巴细胞比值也显著升高[18]。
研究表明EBV感染与患儿免疫功能有很大关系，而TLR7在固有免疫和适应性免疫中起着重要的桥梁作用[19]。IM组TLR7 mRNA表达水平高于对照组，高载量组的TLR7 mRNA表达水平高于低载量组，提示EBV感染能升高TLR7 mRNA表达水平。研究表明髓样树突状细胞可通过TLR7识别EBV衍生的单链RNA，然后募集下游信号、分子，刺激初始T淋巴细胞分化成特异性的细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞等，从而发挥抗病毒作用[20]。本研究ROC曲线分析发现，异型淋巴细胞比值、EBV-DNA载量及TLRI mRNA联合诊断IM时的AUC为0.952，高于单一的异型淋巴细胞比值、EBV-DNA载量及TLR7 mRNA的0.863、0.878、0.792，提示3项指标联合诊断IM的效能更佳。吴菲等[21]研究表明EBV衣壳蛋白(EBV-CA)IgM抗体、EBV-DNA及外周血异型淋巴细胞比值联合检测诊断儿童IM能显著提高特异度，有助于降低误诊率，这与本研究结果类似。当然本研究也存在一些不足，本研究为回顾性研究，研究对象的选择容易产生误差和偏倚，且本研究样本量较少，今后将联合多中心，扩大样本量，进行前瞻性研究。
综上所述，IM患儿的淋巴细胞计数、异型淋巴细胞比值、EBV-DNA载量及TLR7 mRNA表达水平均高于健康儿童，异型淋巴细胞比值、TLR7 mRNA表达水平均与EBV-DNA载量有一定关系，3项指标联合检测能提高诊断IM的效能。
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