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陈 磊，郝小雨，马星竹，周宝库，魏 丹，周 磊，刘荣乐，汪 洪
1.黑龙江省农业科学院土壤肥料与环境资源研究所，黑龙江 哈尔滨 150086 2.中国农业科学院农业资源与农业区划研究所/耕地培育技术国家工程实验室/农业部植物营养与肥料重点实验室，北京 100081 3.北京农林科学院植物营养与资源研究所，北京 100097 4.黑龙江省科学院微生物研究所，黑龙江 哈尔滨 150001 5.农业农村部环境保护科研监测所，天津 300191
土壤有机碳是农业生态系统中重要的生态因子，是作物高产稳产和农业可持续发展的基础，其组分和结构变化直接影响土壤团粒结构、养分固持和有效性，有机碳在温室气体浓度、土壤肥力及其生态功能等方面起着重要作用[1-2]。东北地区是我国重要的黑土区，近十几年来，东北农田土壤有机质和养分含量已发生巨大变化，这主要与农户大量施用化肥(或有机肥)有关[3]。长期监测统计分析表明黑土地区土壤有机质含量维持在18.0～41.2 g·kg-1[4]，与黑土开垦前的有机质平均含量(150.57 g·kg-1)和开垦100年后有机质含量(50.23 g·kg-1)相比[5]，均大幅下降。在保障国家粮食安全、东北耕地质量和减缓温室气体排放等方面的重大需求下，研究东北黑土旱地农田生态系统有机碳转化、土壤固碳现状及固碳潜力具有迫切性与必要性。
据估计，植物固定CO2形成光合产物持续向地下转运，其中根际沉积碳约占植物向根部输入碳的27%，约占净光合作用固定碳的11%[6]，在作物根际微域因沉积碳和根系脱落物引起微生物大量繁殖，是非根际土壤微生物数量的19～32倍[7]，可以提高有机质分解速率300%～500%或者降低10%～30%[7-8]，作物根际有机碳的变化对土壤肥力和作物产量的影响十分关键。最新的核磁共振技术现已广泛应用于土壤有机碳结构研究，常用的是1H-NMR、液态13C-NMR和固态13C-NMR，其中固态13C-NMR因土壤样品预处理简单，不破坏土壤有机质原有结构，根据核磁共振波谱和半定量分析可比较全面的判断土壤有机碳的化学组分和结构[9]。目前，土壤长期肥料定位试验主要用于土壤物理、化学性质、养分供应状况等方面研究，较少有人采用核磁共振技术研究长期不同施肥处理下作物根际土壤有机碳的变化。
以东北平原黑土肥料长期定位试验为基础，以轮作体系下大豆为研究对象，分析长期不同化肥和有机肥施用下根际土壤有机碳、活性有机碳以及有机碳组分结构的变化规律，探讨不同施肥和根际土壤对有机碳稳定机制的影响，研究结果对于评价不同施肥处理对土壤有机碳固存、耕地质量的影响具有重要意义。
1.1 试验概况
长期定位试验区始建于1979年，位于哈尔滨市道外区民主镇黑龙江现代农业示范区(东经126°51′，北纬45°50′)。该区域地势平坦，海拔151 m，属松花江二级阶地，成土母质为洪积黄土状粘土，黑土层厚度为50 cm。气候属中温带大陆性季风气候，冬季寒冷干燥，夏季炎热多雨，年均气温3.5 ℃，昼夜温差较大，年均无霜期135 d，年均降雨量533 mm。1979年定位试验种植小麦，采用小麦-大豆-玉米轮作制，每年一季，设置24个施肥处理，每个处理3次重复，无灌溉设施。初始耕层(0～20 cm)土壤有机碳含量15.5 g·kg-1，全氮含量1.47 g·kg-1，全磷含量1.07 g·kg-1，全钾含量25.16 g·kg-1，有效氮含量151 mg·kg-1，速效磷含量51 mg·kg-1，速效钾含量200 mg·kg-1，pH值7.2。
1.2 试验设计
试验选择2017年10月收获后长期定位试验中不施肥(CK)、常量氮磷钾(NPK)、常量有机肥+常量氮磷钾(MNPK)、常量有机肥(M)等4个处理。所施用化肥为尿素(N 46%)、重过磷酸钙(P2O546%)、磷酸二铵(N 18%、P2O546%)和硫酸钾(K2O 50%)，化肥均为秋收后施用。有机肥为发酵后纯马粪，每次施用前测定养分和含水率，常量施用水平按氮量75 kg N·hm-2，每轮作周期玉米季收获后秋施。常量氮磷钾肥料水平，在轮作周期的小麦季和玉米季为N 150 kg·hm-2，P2O575 kg·hm-2和K2O 75 kg·hm-2，大豆季为N 75 kg·hm-2、P2O5150 kg·hm-2和K2O 75 kg·hm-2。
1.3 样品采集与测定
在2015年秋季玉米收获后施用纯马粪，2016年和2017年分别种植作物小麦和大豆，选择2017年夏季大豆开花结荚期进行田间的根际和非根际土壤样品取样，此时大豆处于生殖生长期，根际效应最为强烈。在各处理小区随机选10株植株，收获地上部，挖取整个根系带回实验室后，轻柔土壤将松散土壤抖掉去除，采用毛刷收集附着在根系表面的土壤为根际土壤，对应选取行间土壤为非根际土壤。过2 mm筛混匀样品，用镊子去除根系、植物残体以及其他杂质，土壤样品装入聚乙烯塑料袋中。土样自然风干用于土壤基础理化性状、有机碳结构测定。
(1)土壤有机碳测定，采用重铬酸钾外加热法测定土壤有机碳含量。
(2)不同活性有机碳测定
不同活性有机碳测定采用高锰酸钾溶液氧化-比色法。33 mmol·L-1KMnO4测定值为高活性有机碳含量，33和167 mmol·L-1测定值的差值为中活性有机碳含量，167和333 mmol·L-1测定值的差值为低活性有机碳，低、中、高活性碳比例是指分别占根际(非根际)土壤总有机碳的比例。
(3)核磁共振测定土壤碳结构
本试验土壤样品使用Bruker Avance 400固体核磁共振仪器。应用13C CP/TOSS技术来辨别有机质特定的官能团。本试验采用4 mm双共振魔角旋转(MAS)探头，13C-NMR的频率为100 MHz。应用13C CP/TOSS试验转速为5 kHz，选好延迟0.8 s，1H 90°脉宽4 μs，交叉极化接触时间为1 ms。在检测之前，应用四脉冲总旋转边带抑制和双脉冲相位调制解耦优化分辨率。本研究中所有NMR图谱中每一官能团在全谱中所占比例均通过积分获取，其中甲氧基积分后所占比例需再除以0.65，用以校正因偶极去相时所引起信号的损失。波谱被分为7个化学位移区域[10-11](见表1)，烷基碳(δ=0～45)/烷氧基碳(δ=45～110)和芳香碳(δ=110～160)/总碳(δ=0～160)比值，可以表征土壤有机质的分解程度和有机质质量[12-13]，脂肪碳/芳香碳和疏水性碳/亲水性碳分别表示土壤有机碳的脂化度及疏水性，其中脂肪碳/芳香碳=[烷基碳(δ=0～45)+甲氧基碳(δ=45～60)+碳水化合物类碳(δ=60～94)+双氧烷基碳(δ=94～110)]/[芳香碳(δ=110～142)+酚芳基碳(δ=142～160)]，疏水性碳/亲水性碳=[烷基碳(δ=0～45)+芳香碳(δ=110～142)+酚芳基碳(δ=142～160)]/[甲氧基碳(δ=45～60)+碳水化合物类碳(δ=60～94)+双氧烷基碳(δ=94～110)+羰基碳(δ=160～220)][14]。
表1 13C NMR CP/TOSS分析波谱中化学位移及其对应成分
1.4 数据统计分析
统计分析采用WPS 2016软件对试验数据进行处理和作图，采用SPSS 19软件对数据进行方差分析(ANOVA)，不同处理之间数据多重比较采用Duncan新复极差法检验(p<0.05)。
2.1 有机碳
图1显示，施肥(M，NPK和MNPK)处理大豆季根际土壤有机碳含量显著高于不施肥处理，且施肥处理间根际土壤有机碳含量差异不明显，大小为MNPK>NPK>M。在非根际土壤中，不同施肥处理有机碳含量变化规律与根际土壤一致，以CK处理有机碳含量最低(14.75 g·kg-1)，施肥处理显著增加了非根际土壤有机碳含量。
所有处理中根际土壤有机碳含量均高于非根际，CK和M处理的根际土壤有机碳比非根际分别高1.2和1.1 g·kg-1，均未达到显著水平，而NPK和MNPK处理均达到显著水平，MNPK处理的根际效应最显著，比非根际增加了14.9%。
图1 黑土长期不同施肥处理对根际和非根际土壤有机碳影响
2.2 不同活性有机碳
从表2可知，在根际土壤中不同处理的低活性有机碳含量为MNPK>NPK>CK>M，但处理间差异不明显。施肥处理显著影响非根际土壤低活性有机碳含量，大小为MNPK>CK>NPK>M，其中MNPK处理的非根际土壤低活性有机碳含量显著大于M处理。MNPK和M处理的根际土壤低活性有机碳高于非根际土壤，而CK和NPK处理根际土壤低活性有机碳含量低于非根际，但均未达到显著水平(表2)。
不同施肥处理对大豆季土壤中、高活性有机碳含量影响不明显，均未达到显著水平。所有施肥处理的根际土壤中活性有机碳含量均高于非根际，而根际土壤高活性有机碳含量均低于非根际，其中M，NPK和MNPK处理达到显著水平。
从表3可知，土壤活性有机碳仅占总有机碳含量的42.9%～57.7%，在活性有机碳中又以低活性有机碳为主，占有机碳比例为18.9%～30.3%，其次是中活性有机碳(16.9%～29.8%)，最低是高活性有机碳(2.67%～3.91%)。根际土壤低活性有机碳/总有机碳比值在不同施肥间差异不明显。在非根际土壤中，CK处理的非根际土壤低活性有机碳/总有机碳比值最高，与M和NPK处理相比均达到显著水平。施肥处理均表现为根际土壤低活性有机碳/总有机碳比值低于非根际的趋势。
表2 黑土长期不同施肥处理对根际和非根际土壤活性有机碳影响
表3 黑土长期不同施肥处理对根际和非根际土壤活性有机碳/总有机碳含量比值影响
CK处理的根际土壤中活性有机碳/总有机碳比值最高。与CK处理相比，M处理显著降低根际土壤中活性有机碳/总有机碳比值。在非根际土壤中，CK处理的中活性有机碳/总有机碳比值也最高，均显著高于M，NPK和MNPK处理。无论在根际还是非根际土壤中，施肥处理(M，NPK和MNPK)间中活性有机碳/总有机碳比值差异不显著(表3)。
在根际土壤中，与CK处理相比，其他处理均显著降低高活性有机碳/总有机碳含量比值，M，NPK和MNPK处理间差异不明显。非根际土壤中，CK处理的高活性有机碳/总有机碳含量比值显著高于M和NPK处理，施肥(M，NPK和MNPK)处理间差异不显著。所有处理中根际高活性有机碳/总有机碳含量比值均显著低于非根际(表3)。
2.3 核磁共振测定土壤碳结构
在根际土壤中，不同施肥处理能够明显影响土壤有机碳不同官能团相对含量，与CK处理相比，施肥处理增加烷基碳、烷基碳/烷氧基碳和疏水性碳/亲水性碳比值，施肥处理的烷基碳相对含量大小为NPK>MNPK>M，烷基碳/烷氧基碳比值为NPK>M>MNPK，疏水性碳/亲水性碳比值为NPK>M>MNPK。与CK处理相比，M处理降低烷氧基碳、芳香基碳和羰基碳。与NPK处理相比，增加有机肥后MNPK处理升高甲氧基碳、碳水化合物类碳和脂肪碳/芳香碳比值，降低烷基碳、芳香基碳、烷基碳/烷氧基碳、芳香碳/总碳和疏水性碳/亲水性碳比值(表4)。
图2 不同处理的土壤有机碳化学组成的NMR谱图
表4 不同施肥下根际与非根际土壤不同官能团相对含量
非根际土壤中，MNPK处理相比于CK处理增加了烷基碳、烷氧基碳、烷基碳/烷氧基碳比值和脂肪碳/芳香碳比值相对含量。与CK处理相比，M处理升高芳香基碳、O-芳香基碳、芳香碳/总碳和疏水性碳/亲水性碳比值。与NPK处理相比，MNPK处理的烷基碳、甲氧基碳、碳水化物类碳、双氧烷基碳、烷基碳/烷氧基碳、脂肪碳/芳香碳比值增加，其他官能团降低或者持平。
不同施肥处理的根际与非根际土壤13C-NMR图谱中吸收峰相似，只是吸收峰的相对强度存在明显差异，表明不同施肥处理未能改变根际与非根际土壤中有机碳的碳骨架，仅是改变了有机碳中官能团的数量。与CK处理的非根际土壤相比，根际土壤增加甲氧基碳、碳水化物类碳、双氧烷基碳、羰基碳、脂肪碳/芳香碳比值，而降低其他官能团相对含量及烷基碳/烷氧基碳、芳香碳/总碳和疏水性碳/亲水性碳比值。与根际土壤中CK处理相比，单纯施用M和NPK处理能够增加根际土壤有机碳中烷基碳相对含量，NPK处理降低羰基碳及增加烷基碳/烷氧基碳比值，M处理降低根际土壤羰基碳；
而MNPK处理调节根际土壤有机碳中甲氧基碳和双氧烷基碳，导致其相对含量降低。
由于植物向根系转运的沉积碳和根系脱落物在根际微域的持续输入，导致根际微生物大量繁殖，土壤有机碳转化快，与非根际土壤存在明显差异。有研究显示，土壤碳素的内循环主要发生在植物根际微域中，在土壤、微生物和动植物体内不断快速迁移和转化。本研究发现，不论是否施肥，大豆季根际土壤有机碳含量均高于非根际土壤，长期施肥处理能够显著增加外源碳输入量，增加根际与非根际土壤中总有机碳和低活性有机碳的累积，其中以NPK配施有机肥处理提升效果最好。13C-核磁共振结果表明，相比于CK处理，NPK配施有机肥处理明显增加根际土壤烷基碳(δ=0～45)、烷氧基碳(δ=45～110)比例以及烷基碳/烷氧基碳比值，降低芳香基碳(δ=110～160)和芳香碳/总碳比值，在非根际土壤中尤其显著。研究证明烷氧基碳(δ=45～110)升高能够改善土壤物理结构、腐殖酸合成以及生物活性，促进土壤团聚体形成和增加土壤颗粒结构稳定性[15]，烷氧基碳的转化效率与土壤粘粒含量呈正相关[16]，粘粒又促进团聚体的形成和稳定，降低微生物对团聚体中碳素的降解，同时，烷基碳比例、烷基碳/烷氧基碳比值可以用来显示有机碳的分解程度以及稳定性，烷基碳比例和烷基碳/烷氧基碳比值越大，表明有机质分解越彻底且有机碳越稳定[12-13]，有机无机配施通过改变土壤有机碳组分比例和结构起到固碳的作用。与CK处理相比，单施化肥(NPK)处理无论在根际和非根际土壤均增加芳香基碳(δ=110～160)比例和芳香碳/总碳比值，而烷基碳(δ=0～45)比例、烷氧基碳(δ=45～110)和烷基碳/烷氧基碳比值在根际和非根际土壤存在差异，在根际土壤烷基碳(δ=0～45)比例和烷基碳/烷氧基碳比值增加，烷氧基碳(δ=45～110)比例降低，非根际土壤中结果相反。表明NPK处理能够增加根际有机碳难降解组分烷基碳(δ=0～45)和芳香基碳(δ=110～160)的比例，降低根际土壤的团聚化，增加根际土壤微生物对有机碳的降解。
NPK配施有机肥能够显著提升根际有机碳含量，增加有机碳中烷基碳、烷氧基碳比例以及烷基碳/烷氧基碳比值，增加了土粒的团聚化，提高了有机碳的稳定性，而单施化肥处理增加芳香基碳比例和芳香碳/总碳比值，降低根际烷氧基碳比例，团聚体稳定性降低，同时证明固态13C-核磁共振技术结合半定量分析可以比较全面地分析土壤有机碳结构组分的波谱特征。
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