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＊洪霞 苟敏 汤岳琴*
（1.中石化上海工程有限公司 上海 200120 2.四川大学建筑与环境学院 四川 610207 3.四川省环境保护有机废弃物资源化利用重点实验室 四川 610207）
燃料乙醇是燃烧清洁的高辛烷值燃料，有辛烷值高、抗爆性能好等优点，是一种可再生能源。但因其生产成本较高，相对汽油无明显价格优势，因此，目前还缺乏市场竞争力。高温高浓度乙醇发酵技术可降低乙醇生产中冷却、精馏等过程的投入和能耗，同时减少废液的排放，降低污水处理成本，是目前燃料乙醇生产技术领域最具发展潜力的技术之一[1]。
耐高乙醇、耐高温菌株是实现高温高浓度乙醇发酵的基础。利用生物质生产燃料乙醇的研究主要以酿酒酵母为主，虽然其能耐受较高的乙醇浓度，但其发酵温度一般在30～35℃。与酿酒酵母相比，马克斯克鲁维酵母具有耐高温（45～48℃）、可利用多种六碳糖和五碳糖等特点，近年来逐渐被燃料乙醇的研究者们所关注[2]。但马克斯克鲁维酵母的耐乙醇能力相对较差，有采用自然选育、基因工程、驯化等手段提高克鲁维酵母的乙醇发酵能力的报道[3-4]，但目前对马克斯克鲁维酵母乙醇耐受性提高的研究还很有限[5-6]。乙醇耐受分子机制复杂，改变一个或少数几个基因的表达，难以达到目的，对细胞进行全局优化和调控才有可能获得目标表型的菌株。Mo等[5]通过在乙醇胁迫条件下的100天的反复传代培养，获得了乙醇耐受能力得到提高的马克斯克鲁维酵母菌群KM-100d，该菌群在30℃发酵时，耐受6%和8%初始乙醇浓度的能力有明显提升。但是利用马克斯克鲁维酵母进行乙醇发酵是基于高温条件才能发挥其优势，因此提升其在高温发酵条件下乙醇的耐受是实现其工程应用的基础。高温和乙醇对酵母都会产生胁迫，当两者同时存在时会产生协同抑制作用，因此提升酵母在高温条件下乙醇的耐受能力比较困难。Li等[6]通过建立TATA-结合蛋白Spt15的突变库并转化马克斯克鲁维酵母，筛选获得一株在45℃条件下耐受乙醇能力得到提升的菌株M2，其发酵停止的乙醇浓度为57g/L，而出发菌株的发酵停止乙醇浓度为47g/L。由于相关研究非常有限，针对如何能成功地提升马克斯克鲁维酵母在高温发酵条件下的乙醇耐受能力尚没有很好的对策，需要更多的技术尝试和探索。
紫外照射等物理诱变或甲基磺酸乙酯处理等化学诱变是获取突变菌株的重要途径，特别是当目标表型的分子机制不清的情况下，具有重要意义。相比传统的物理或化学诱变方法，常压室温等离子体（ARTP）诱变技术作为一种新型的生物诱变技术，具有突变频率高、遗传稳定性好、快速安全等特点，已应用于多种生物的诱变选育[7]，在产油酵母、酿酒酵母诱变方面已有成功案例[8-10]。金丽华等[8]使用ARTP技术诱变产油酵母，在致死率为99%的情况下，通过比较突变菌株和出发菌株的生长速度，发现酵母细胞的正突变率为27.2%，突变菌株的产脂率可提高118%。Liu等[9]结合ARTP诱变和高通量筛选，获得了一株积累乙醛能力较低的突变酿酒酵母LAL-8a。与野生型相比，突变菌株的乙醇脱氢酶活性降低54%，醛脱氢酶活性提高64%，乙醛积累量减少88.2%。Wang等[10]利用ARTP诱变结合基因组重排获得了耐乙醇、耐高温、耐高糖和耐高盐的多重耐受酿酒酵母菌株。但到目前为止，ARTP诱变技术在马克斯克鲁维酵母的应用尚未有报道。
本研究前期工作中对多株马克斯克鲁维酵母进行了高温耐受性、乙醇耐受性、利用各种糖能力的评价，筛选出了一株各方面性能均较好的菌株。本文以该菌株为出发菌株，对其进行了ARTP诱变，通过平板培养初筛、液体培养复筛、摇瓶发酵等对突变菌株进行了筛选，获得了乙醇耐受得到提升的突变菌株，为后续的进一步性能优化提供了菌株来源。
(1)培养基
2% YPD平板培养基：1%酵母浸出粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%琼脂。用于酵母的活化。
5% YPD液体培养基：1%酵母浸出粉，2%蛋白胨，5%葡萄糖。用于酵母的预培养。
含乙醇选择培养基：1%酵母浸出粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%琼脂。培养基灭菌后加入用0.22μm滤膜过滤的无水乙醇，制成含4%（V/V）、5%（V/V）、6%（V/V）、7%（V/V）、8%（V/V）乙醇的平板培养基。
复筛培养基：1%酵母浸出粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖。培养基灭菌后加入用0.22μm滤膜过滤的无菌无水乙醇制成含4%（V/V）乙醇的液体培养基。
发酵培养基：2%酵母粉，4%蛋白胨，15%葡萄糖。培养基灭菌后加入用0.22μm滤膜过滤的无水乙醇制成含3%（V/V）乙醇的液体培养基。
上述所有培养基的灭菌条件为121℃，15min。
(2)菌株及评价方法
①菌株
实验室保藏的马克斯克鲁维酵母菌株KM1。
②菌株KM1生长曲线的测定
将保存的酵母菌株接种于2% YPD平板培养基，45℃恒温培养箱活化培养24h，挑选活化的细胞接种至2% YPD液体培养基中，置于160rpm的45℃恒温摇床中进行预培养16h。收集细胞，转接至5% YPD液体培养基中（初始OD660为0.05），置于45℃、180rpm恒温摇床培养，定时采样，在660nm波长下测定吸光度（OD660）值。以时间为横坐标、OD660值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
③ARTP诱变处理
利用ARTP等离子体诱变仪（ARTP-M）对酵母细胞进行诱变，诱变时工作气体为氦气，产生的等离子体温度在25～ 35℃之间。将菌株在2% YPD平板，45℃恒温培养箱活化16h，取细胞接种于5% YPD液体培养基中，放入45℃、180rpm恒温摇床中，预培养12h。取1mL菌悬液于无菌离心管中，离心10min，菌体用无菌生理盐水洗涤两遍，取10µ L菌悬液至照射玻片上涂匀，设置处理时间分别为0s、30s、60s、90s、120s、150s，对其进行诱变处理。将处理后的玻片放入1mL的生理盐水中保存，每个处理时间均有三组平行样，最后进行混合。取0.1mL混合后的菌悬液稀释10-1和10-2两个梯度，均匀涂布于2% YPD固体培养基上，放入45℃培养箱中培养24h，对菌落进行计数。与出发菌株进行对比，计算出经ARTP诱变后酵母细胞的存活率。以处理时间为横坐标，致死率为纵坐标，绘制致死率曲线。在适宜诱变处理时间下，建立菌株的等离子体诱变突变库，将诱变后的菌液制作成菌保，于-80℃冷冻保存，备初筛、复筛用。
④突变菌株平板生长初筛
取诱变后的细胞液0.2mL接种于5% YPD液体培养基中，45℃、180rpm恒温摇床培养24h，取对数期的1mL菌悬液分别稀释10-2、10-3，各取0.1mL涂布于含4%（V/V）、5%（V/V）、6%（V/V），7%（V/V）、8%（V/V）乙醇的2% YPD平板培养基（每组5个平行），放入45℃培养箱中培养48h。挑选出86个比出发菌株生长情况好的菌落，转移至2% YPD平板培养基中培养。
⑤突变菌株液体生长复筛
将挑选的突变菌株和原菌株进行预培养，收集细胞，接种于5mL含4%（V/V）乙醇的5% YPD液体培养基中（初始OD660约0.05），在45℃，30rpm条件下，于小型恒温振荡仪培养36h，测量其OD660值。选取OD660值大于出发菌株的5株突变菌株进行后续摇瓶发酵。
⑥突变菌株的摇瓶发酵
将各菌株接种于2% YPD平板培养基中45℃恒温培养箱活化24h。挑取细胞接种于5% YPD液体培养基，45℃、160rpm预培养12h。取10mL预培养液，5000rpm离心去上清液，称菌体重量。称取0.25g（湿重）细胞接种到装有100mL含3%（V/V）乙醇的15% YPD液体培养基的300mL三角瓶中，置于45℃、200rpm水浴锅发酵，24h后分析细胞量、残糖和乙醇浓度。
(3)分析方法
①细胞浓度测定
取2mL菌悬液于2ml离心管，稀释一定倍数使得吸光度值小于1，用UV-VIS分光光度计（JASCO，Japan）在660nm波长下测定吸光度值OD660。
②还原糖和乙醇质量浓度分析
发酵液离心后分别收集上清液，用0.22µ m的滤膜过滤后用于乙醇和残糖质量浓度分析。葡萄糖质量浓度利用高效液相色谱仪（LC-10AD VP，岛津，日本）进行分析，检测器为荧光检测器RF-10AXL，流动相为硼酸缓冲液，反应液是硼酸和精氨酸的混合液。检测条件：炉温为150℃，柱温为65℃。用1g/L葡萄糖标样，外标法计算葡萄糖含量。
乙醇质量浓度利用气相色谱仪（GC353B，GL sciences，日本）进行分析，用异丙醇作为内标。检测条件：氦气作为载气，氢气作为燃气，炉温为50℃，注射器为180℃，检测器温度为180℃。
根据所测葡萄糖和乙醇的质量浓度，按以下公式计算乙醇收率：
(1)马克斯克鲁维酵母菌株KM1的生长曲线和ARTP处理时间对菌株存活率的影响
菌株KM1的生长曲线如图1（a）所示。在5% YPD中，培养12h后该菌株处于对数生长期后期。此时细胞生长繁殖旺盛，对外界环境的影响相对比较敏感，在此阶段对细胞进行等离子体诱变处理，可以增加基因突变与稳定遗传的几率。将未经等离子体辐照和经等离子体辐照30s、60s、90s、120s、150s的菌悬液涂布于2% YPD固体培养基中，培养48h，计算菌落的个数，得到不同等离子体辐照时间下细胞的存活率，如图1（b）所示。可以看出，当处理时间为60s时，细胞存活率为2%，60s的处理时间可以用于突变细胞库的构建。相比酿酒酵母[10]，菌株KM1对常温等离子体辐射相对更敏感。
图1 菌株KM1的生长曲线（a）和ARTP处理时间对菌株存活率的影响（b）Fig.1 Growth curve of strain KM1 (a) and the effect of ARTP treatment time on cell viability (b)
(2)马克斯克鲁维酵母突变菌株的乙醇平板初筛
选取60s的照射时间进行细胞诱变处理。取诱变后的细胞悬液0.2mL接种于5% YPD液体培养基中，45℃、180rpm恒温摇床培养24h，细胞浓度达到17（OD660）。取1mL菌悬液稀释102和103倍，取0.1mL涂布于含4%（V/V）、5%（V/V）、6%（V/V），7%（V/V），8%（V/V）乙醇的2% YPD平板培养基。置于45℃培养箱中培养48h。
当2% YPD固体培养基中乙醇体积分数小于6%时，细胞的生长几乎没有受到影响，菌落生长密集。乙醇体积分数为8%时，细胞生长受到强烈抑制，无菌落生长。因此，从乙醇体积分数为7%（v/v）的YPD平板上将生长明显优于出发菌株的86株突变菌株挑出，进行下一步的复筛研究。
(3)马克斯克鲁维酵母突变菌株的液体生长复筛
对从乙醇平板上初筛得到的突变菌株，在45℃，含4%（V/V）乙醇的5% YPD液体培养基中进行培养，比较它们的生长情况。图2为出发菌株和所有突变菌株在36h的细胞浓度（OD660）数据。
图2 出发菌株和突变菌株在含4%（V/V）乙醇的5% YPD培养基中培养36h后的细胞浓度Fig.2 Cell density of original and mutant strains cultivated for 36 h in 5% YPD medium containing 4% (V/V) ethanol
在含4%（V/V）乙醇的抑制条件下，生长至36h后，初筛得到的86株突变菌株中有57株的OD值大于出发菌株（OD660=3.31）。其中M02、M16、M32、M40和M48的OD660超过了4.0，针对这5株突变菌株，进行了下一步的摇瓶发酵评价。乙醇平板初筛和液体生长复筛的结果表明，ARTP诱变可产生有利于马克斯克鲁维酵母在乙醇胁迫下生长的突变，对于提升菌株的乙醇耐受能力是有效的。当然，从生长结果也可看出，ARTP诱变并未获得在4%（V/V）乙醇胁迫条件下细胞生长得到非常明显提升的突变子。这点和酿酒酵母的ARTP诱变结果类似，一次ARTP诱变在提高酿酒酵母的乙醇耐受性方面提高幅度也是比较有限的[10]。
(4)马克斯克鲁维酵母突变菌株的摇瓶发酵
在45℃，出发菌株和突变菌株利用含3%（V/V）初始乙醇的15% YPD液体培养基发酵24h后的结果，如表1所示。可以看出，除M02外，其他四株突变菌株的生长情况略优于出发菌株，OD660的提升率为6.9%～15.8%。糖消耗速率方面，有三株明显优于出发菌株，提高6.30%～15.7%，有两株低于出发菌株，特别是M48，比出发菌株低了15.7%。但是糖消耗速率和细胞浓度之前不存在相关性。在乙醇收率方面，所有突变菌株的乙醇收率均高于出发菌株，但提升幅度不一，19.1%～58.0%，糖消耗速率较慢的两株突变菌株的乙醇收率相对更高。从以上结果可以看出，ARTP诱变对细胞代谢的影响，在细胞生长、糖的利用、乙醇积累三个方面均有表现。突变菌株在表型上具有多样性，可能是不同突变菌株可具有不同突变位点所导致的。五株突变菌株表型各有优势，M02和M48在乙醇收率上有显著优势，而M16、M32和M40在糖的消耗速率上有显著优势。后续可以以这5株突变菌株为出发菌株，通过其他技术手段如基因组重排等获得更优的高乙醇耐受马克思克鲁维酵母菌株。
表1 出发菌株和突变菌株利用含3%（V/V）初始乙醇的15% YPD培养基发酵24h后的结果Tab.1 Fermentation results of original and mutant strains when using 15% YPD medium containing 3% (V/V) ethanol
目前尚未有通过物理或化学诱变提升马克斯克鲁维酵母乙醇耐受能力的研究报道。相比乙醇胁迫条件下的马克斯克鲁维酵母的自然驯化突变或基于全局转录调控因子的随机突变改造[5-6]，本研究利用ARTP诱变技术，可以获得表型多样的耐乙醇马克斯克鲁维酵母突变菌株，为整合有益突变获得更优秀菌株提供了可能，也为进一步改造提供了性能多样的出发菌株资源。
高温高浓度乙醇发酵对于降低燃料乙醇生产成本提高其生产经济效益具有重要意义。为满足高温高浓度乙醇发酵对发酵菌株耐高乙醇浓度、耐高温的要求，本文以前期筛选出的耐高温马克斯克鲁维酵母菌株KM1为出发菌株，探讨了常温等离子体（ARTP）诱变提升其乙醇耐受性的可行性。结果表明，菌株KM1对ARTP诱变敏感，60s的处理条件下，存活率仅为2%。诱变后获得了大量在4%（V/V）乙醇胁迫条件下生长优于出发菌株的突变菌株，但最高提升率仅约20%，未发现生长显著提高的突变菌株。乙醇胁迫条件下的发酵评价结果表明，突变菌株表现均优于出发菌株，24h内的乙醇积累量高出出发菌株37.9%～47.5%。但突变菌株间表型差异明显，特别在糖利用速率以及乙醇收率上差异显著，各有优势。本研究所获得的突变菌株为后续通过其他技术手段如基因组重排等获得更优的高乙醇耐受马克斯克鲁维酵母菌株提供了基础。
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