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张潇晗，牛丽颖，2，3，毕晓东，2，3
(1 河北中医学院，河北 石家庄 050091；
2 河北省中药配方颗粒创新中心，河北 石家庄 050091；
3 河北省中药材品质评价与标准化工程研究中心，河北 石家庄 050091)
苦参，为豆科槐属植物，苦参的干燥根可作为中药。其味苦、性寒，归心、肝、胃、大肠、膀胱经，具有清热燥湿、杀虫、利尿之功效[1]。苦参的种植范围比较广，随着各地的自然环境的变化，山西、贵州、陕西、河北、辽宁的栽培种植面积逐渐扩大，成为大家公认的道地产地[2]。苦参研究报道中主要化学成分分为生物碱类、黄酮类、二苯甲酰基衍生物、萜类、脂肪酸、挥发油类等[3]。其中苦参碱和黄酮类化合物是苦参最主要的化合物，生物碱作为苦参的特征性成分，近年来备受关注。经文献检索发现，近年来对于苦参生物碱的研究主要集中于苦参碱抗肿瘤抗肝癌作用，氧化苦参碱治疗胰腺炎、阴道炎等多种药理作用。由于这两种成分的结构相似(图1)，因此对于苦参碱和氧化苦参碱的分离分析具有较大的应用价值。
图1 两种苦参生物碱的化学结构式Fig.1 Chemical structural formulae of two sophora flaveseed alkaloids
经文献调研发现，关于苦参中生物碱类成分的分离分析常用到的有薄层色谱法[4，5]，气相色谱法[6]，高效液相色谱法[7]和高效液相色谱法串联质谱法[8]等。加压毛细管电色谱(Pressurized capillary electrochromatography， pCEC)是结合了毛细管电色谱和高效液相色谱法的一种新发展起来的分离分析技术，具有电渗流和压力的双重驱动力，根据分配系数的不同，从而实现样品的高速分析。本实验采用新型高效环保的加压毛细管电色谱法，对苦参中两种生物碱成分进行分离。
1.1 仪器试剂
TriSepTM-2100加压毛细管电色谱，上海通微分析技术有限公司；
UV-2102PC 型紫外-可见分光光度计，上海尤尼柯仪器有限公司；
KQ250型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；
BSA224SCW电子分析天平，北京赛多利斯；
旋涡混合器；
滤头，注射器；
纯水机。
苦参碱和氧化苦参碱(含量均为98%)，北京百灵威科技有限公司；
苦参药材(批号121019-201407)，中国食品药品鉴定研究院；
乙腈(色谱纯)，Fisher化学试剂公司；
其他试剂均为分析纯，实验用水为RO级别用水。所有试剂和溶液在进样器前都需要用0.2 μm滤膜过滤，流动相需超声除气。
1.2 实验方法
分别精密称取苦参碱以及氧化苦参碱适量加适量乙腈溶解，配置成质量浓度为1 mg·L-1的标准品储备液，超声十分钟，备用。临用时分别稀释成0.33 mg·L-1的对照品溶液用旋涡混合器震荡摇匀，待用。
pCEC-UV色谱条件，毛细管填充柱(EP-100-20/45-3-C18，内径 100 μm，总长度 45 μm，有效长度20cm，ODS填料内径3 μm)；
流动相：流动相为乙腈-3%乙酸溶液(97∶3)；
流动相的流速为0.06 mL/min，分离电压为0 KV，紫外检测波长为220 nm。进样量 1.5 μL；
电压施加在毛细管的出口端，进口端接地。
2.1 流动相的优化
本实验对流动相的种类以及体积分数进行了优化，首先选用甲醇-0.1%磷酸水溶液(10∶90)，此时苦参碱与氧化苦参碱可成功分离，但是当检测波长为210时溶剂峰较大，溶剂影响明显。因此将甲醇替换成乙腈进行后续实验，选用乙腈-1%乙酸水溶液(90∶10)，此时苦参碱和氧化苦参碱不能完全达到极限分离。提高乙酸水溶液的浓度，可明显改善峰形，提高灵敏度。进一步继续改善流动相的体积分数，实验发现当选用乙腈-3%乙酸水溶液(97∶3)时，基线可以得到很好的分离，峰形较好.本实验同时考察了以氯化铵和异丙醇为添加剂对苦参碱和氧化苦参碱分离的影响，实验发现两种添加剂会对基线造成较大波动，导致平衡时间过长，因此最终选97%的乙腈为有机相，3%乙酸水溶液为水相流动相。
2.2 流速和分离电压的选择
流速的大小直接改变柱压，从而影响出峰时间以及分离度，本实验考察了(0.04，0.05，0.06 mL/min)三种流速对苦参碱和氧化苦参碱的分离效果。实验表明在压力允许的范围内，流速的增大，可减小分离时间，缩短单个组分的出峰时间。流速小，单个组分出峰时间过长，因此本实验选择 0.06 mL/min的流速。电压的增加会改变电渗流的大小，从而影响各组分之间的保留情况。本实验考察了(-5，-3，-1，0，1，3，5)七种电压大小，结果表明，在毛细管出口端施加正电压时，两种生物碱出峰时间提前，导致基线分离受到影响，无改善峰形等影响效果。并且随着电压的增大，电流持续时间增长，会出现焦耳热，从而增加基线的平衡时间。对比不加电压的情况，综合选择0 kV为分离电压。此时氧化苦参碱在10 min处先出峰，苦参碱在14 min处出峰。
图2 混标(流速0.06，进样量1.5 μL)Fig.2 Mixed standard (flow rate of 0.06， sample volume of 1.5 μL)
图3 氧化苦参碱(流速0.06，进样量1.5 μL)Fig.3 Oxymatrine (flow rate of 0.06,sample volume of 1.5 μL)
图4 苦参碱(流速0.06，进样量1.5 μL)Fig.4 Matrine (flow rate of 0.06, sample volume of 1.5 μL)
图5 乙腈(流速0.06，进样量1.5 μL)Fig.5 Acetonitrile (flow rate of 0.06， sample volume of 1.5 μL)
图6 苦参药材(流速0.06，进样量1.5 μL)Fig.6 Sophora flavescens (flow rate of 0.06, sample volume of 1.5 μL)
本文建立了加压毛细管电色谱分离苦参两种生物碱类成分，在18 min内实现了苦参碱和氧化苦参碱的两种种生物碱快速高效分离，该方法的分离时间短，消耗有机试剂量小，为苦参等生物碱类成分的分离提供了一种新型快速高效的分离方法。对于苦参碱和氧化苦参碱的分离分析具有较大的现实意义和应用价值。
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