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朱玉婷，文 欣，向 俊,3，郭锦材，荆辉华，李 灿，陈同强,5,
（1.三二〇一医院药学部，陕西 汉中 723000；
2.湖南省产商品质量检验研究院，湖南 长沙 410007；
3.中南大学化学化工学院，湖南 长沙 410083；
4.长沙市口腔医院，湖南 长沙 410006；
5.中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 410004）
植物乳杆菌作为一类食源性微生物，因其安全性高，在工业、食品和医药等重要领域占有一席之地，其在发酵过程中产生的胞外多糖被广泛应用于食品生产、制药及化工生产等领域[1-4]。多糖一般由10 个（含）以上的单糖通过糖苷键缩聚而成。随着现代工业的迅速发展，多糖已被广泛应用于食品、医药等领域。大量的药理及临床实验表明，大多数多糖类化合物具有一定的药理活性，且一般无毒副作用[5]。近年来，多种不同来源的产胞外多糖植物乳杆菌被研究者们分离出来，并进行了大量的深入研究，与植物源多糖比较，植物乳杆菌胞外多糖具有自身独特的理化特性，如高黏度、浓稠、剪切稀释等[6-8]。
植物乳杆菌胞外多糖作为一类新型天然食品添加剂，可改善酸乳、低脂干酪等发酵乳制品的质地、口感、风味及稳定性等，因此，无需添加其他添加剂即可提高发酵乳制品的黏度和组织状态[9]。分析单糖组成是鉴定多糖结构的重要环节之一，采用气相色谱（gas chromatography，GC）法测定糖类，主要问题是糖类本身的难以挥发性，需将其转化成易挥发、遇热不易分解的衍生物。已有研究将单糖转化成糖腈乙酸酯衍生物，该方法具有制备过程简便、试剂较易获取等优点，并且每种单糖均可获得单一色谱峰。目前对植物乳杆菌胞外多糖的研究主要体现在粗多糖的提取方法及其抗氧化、抗肿瘤等药理作用方面[10-11]，但关于植物乳杆菌胞外多糖纯组分的结构及药理活性的文献报道较为鲜见。本研究以自制酸菜中分离出的植物乳杆菌发酵液为原料，经乙醇沉淀后得到粗多糖，再经一系列处理，包括脱色、脱蛋白、柱色谱分离纯化等过程最终得到2 种新的多糖组分，通过分析这2 种多糖化合物的单糖组成及研究其体外抗氧化活性，为植物乳杆菌胞外多糖的构效关系研究及植物乳杆菌的综合开发利用提供基础。
1.1 材料与试剂
植物乳杆菌，分离自湖南岳阳某农家自制酸菜。
DEAE-52阴离子交换纤维素 英国Whatman公司；
30%双氧水 南京化学试剂股份有限公司；
三氯乙酸、氢氧化钠、盐酸、硫酸、醋酸钠、醋酸 阿拉丁试剂（上海）有限公司；
所有实验试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
GC2410气相色谱仪 日本岛津公司；
UV-9000双光束紫外-可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；
LGJ-12N冷冻干燥机 北京亚星仪科科技发展有限公司；
透析袋（截留分子质量3.5 kDa） 中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；
BS-100N自动部分收集器、BT100N数显恒流泵 南北仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 粗多糖的制备
实验用植物乳杆菌经连续2 代活化后，转接至脱脂乳培养基中，37 ℃条件下静置培养20 h，然后加入三氯乙酸至其在发酵液中最终质量浓度约为5.0 g/L。室温搅拌1 h左右，4 ℃、5 000 r/min离心5 min除去发酵液中的细胞、蛋白等杂质。取上清液，加入95%乙醇使得粗多糖溶液中乙醇最终体积分数为80%，静置过夜，5 000 r/min离心5 min，弃上清液，收集沉淀，冷冻真空干燥，得到粗多糖，命名为DZ。
1.3.2 DZ的分离纯化
DZ采用Savag法除蛋白和H2O2法脱色素[11]后，浓缩样液，再按1.3.1节方式醇沉2 次，将得到的沉淀溶解于水中，自来水流水透析24 h，真空冷冻干燥，待用。
准确称取经上述处理后的50 mg DZ置于20 mL醋酸钠-醋酸（NaAc-HAc）缓冲盐溶液（pH 5.2）中，溶胀过夜，过阴离子交换柱（DEAE-52，Cl-，2.5×90 cm）（填料纤维素阴离子交换剂DEAE-52先后经0.1 mol/L NaOH、0.1 mol/L HCl处理1 h，水洗至中性），先用NaAc-HAc缓冲盐溶液（pH 5.0）平衡24 h，装样，依次采用含0、0.2 mol/L NaCl的NaAc-HAc缓冲盐溶液（pH 5.2）作为流动相进行洗脱，流速为1 mL/min，以苯酚-硫酸法（490 nm）[12]隔管示踪，以奇数管号为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制曲线，收集主峰部分，自来水流水透析24 h，真空冷冻干燥。
1.3.3 单糖组成分析
1.3.3.1 标准单糖糖腈乙酸酯衍生物的制备
分别称取葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、肌醇（内标）各4.0 mg，加入5 mg盐酸羟胺与0.2 mL吡啶，密封，于90 ℃烘箱中反应30 min后，冷却，加入0.2 mL醋酸酐，90 ℃继续加热反应30 min，冷却，加入1 mL水和1 mL氯仿萃取3 次，取氯仿层，减压浓缩至干，残渣加1 mL氯仿复溶，混匀，即得标准单糖衍生物，待进样。
1.3.3.2 多糖水解及糖腈乙酸酯衍生化
称取经分离纯化后的多糖组分4.0 mg，加入肌醇（内标）4.0 mg，加入2 mL 2 moL/L三氟乙酸，90 ℃密闭水解10 h，减压蒸干，加入1 mL甲醇再蒸干，重复3 次，以彻底除去多余三氟乙酸。之后处理与标准单糖衍生物制备过程相同，处理后待进样。
1.3.3.3 GC条件
氢火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID），OV-101石英毛细管柱（50 m×0.25 mm，0.33 µm）；
程序升温：160 ℃，保持4.0 min，以5 ℃/min升至190 ℃，保持4.0 min，然后以3 ℃/min升至210 ℃，保持15.0 min，最后以10 ℃/min升至260 ℃，保持5 min；
进样口温度210 ℃，进样模式：分流；
分流比50∶1；
FID温度280 ℃。
采用内标法测定多糖样品中单糖含量，计算方法参考文献[13]。
1.3.4 抗氧化活性测定
将分离纯化后的多糖分别配制成质量浓度为0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0 mg/mL的系列溶液，参照文献[13-15]方法，测定植物乳杆菌胞外多糖组分对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羟自由基和2,2’-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）阳离子自由基的清除率，上述实验均采用VC作为阳性对照。
1.4 数据处理
采用Excel 2010软件进行数据处理及绘图。
2.1 DZ的提取
水的渗透能力较强，提取效率高，使用时安全且经济。用水作为溶剂来提取多糖，所得多糖提取液可直接或离心除去不溶物；
或者利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质，沉淀提纯多糖；
但由于不同性质或不同相对分子质量的多糖沉淀所需乙醇体积分数不同，它也可以用于样品中不同多糖组分的分级分离；
还可按多糖不同性质在粗分阶段利用混合溶剂提取法对样品中不同的多糖进行分离；
其中，以乙醇沉淀最为普遍。本研究采用体积分数95%乙醇溶液可以一次性将样品中大部分多糖成分沉淀出来。
植物乳杆菌胞外多糖经水提醇沉法处理后得到粗多糖DZ，经改良苯酚-硫酸法测定，DZ总糖含量约为70.2%。采用乙醇进行沉淀时，需缓慢加入乙醇，同时边加边搅拌，整体溶液pH值需保持近中性，以避免产生共沉淀现象，影响多糖的提取效果。
2.2 DZ的分离纯化
除蛋白质时一般选择能使蛋白质沉淀而不使多糖沉淀的试剂来处理，如酚、三氯乙酸、鞣酸等。但需处理时间短、温度低，避免多糖降解。Sevag法（氯仿、戊醇/丁醇体积比4∶1）在避免多糖降解方面有较好效果。
粗多糖需要采用Sevag法进行脱蛋白处理，考马斯亮蓝法进行跟踪检测，直至完成蛋白去除。脱蛋白后的多糖中含有大量色素，需采用双氧水进行脱色处理，需要注意的是，因双氧水具有较强氧化性，因此用量不宜过大，否则可能会氧化导致多糖结构被破坏，本研究通过优化最终采用体积分数20%双氧水进行脱色。
DZ经过脱蛋白、色素等处理后，再经DEAE-52 Cl-离子交换柱色谱分离，含0.2 mol/L NaCl的NaAc-HAc缓冲盐溶液（pH 5.0）为流动相洗脱得到DZ-1和DZ-2 2 个多糖组分，如图1所示，2 个多糖组分经柱层析分离流出，采集峰形，谱图基本呈单一对称，可推测2 个多糖组分纯度较高。
图1 DZ的阴离子交换纤维素柱色谱洗脱图Fig.1 Elution curve of the crude polysaccharides from anion exchange cellulose column
2.3 DZ-1与DZ-2的单糖组成分析
采用内标法测定多糖样品中单糖含量并计算其含量百分比。由图2可知，6 种单糖完全分离且均呈现单一对称峰。由图3可知，DZ-1为由葡萄糖组成的均多糖。由图4可知，DZ-2为由阿拉伯糖、半乳糖组成的杂多糖，通过计算得到DZ-2的单糖组成及百分比含量比值为阿拉伯糖∶半乳糖=46.03∶53.89。
图2 混合单糖标准品的GC图Fig.2 GC chromatogram of a standard mixture of monosaccharides
图3 DZ-1的GC图Fig.3 GC chromatogram of DZ-1
图4 DZ-2的GC图Fig.4 GC chromatogram of DZ-2
2.4 DZ-1与DZ-2的抗氧化活性分析
2.4.1 DPPH自由基清除实验
DPPH自由基作为一类稳定的有机氮自由基，可接受电子或氢自由基生成稳定的分子[16]。DPPH自由基清除率时常在体外抗氧化活性实验中被用于评价天然化合物的抗氧化活性[17]。由图5可知，DZ-1与DZ-2对DPPH自由基的清除能力均表现出一定的量效关系，即随着质量浓度的升高而逐渐增强。其中，DZ-2对DPPH自由基的半抑制质量浓度（IC50）为0.25 mg/mL，VC对DPPH自由基的IC50为0.04 mg/mL。DPPH自由基清除率在DZ-1与DZ-2质量浓度为0～1.0 mg/mL时均呈现上升趋势，当DZ-1与DZ-2质量浓度为1.0 mg/mL时，二者清除率达到最大值，分别为45.63%与62.11%，而阳性对照组VC对DPPH自由基的清除率则高达97.80%。
图5 DZ-1与DZ-2的DPPH自由基清除效果Fig.5 DPPH radical scavenging effects of DZ-1 and DZ-2
2.4.2 羟自由基清除实验
作为一类反应性极强的自由基，羟自由基的破坏性极强，能轻易穿透细胞膜，与其中多种生物分子发生反应，从而造成组织损伤或细胞凋亡。因此，清除羟自由基对保护生物系统具有极为重要的作用[18-22]。由图6可知，DZ-1与DZ-2对羟自由基的清除能力均表现出一定的量效关系，即随着质量浓度的升高而逐渐增强。其中，DZ-2对羟自由基的IC50为0.30 mg/mL，VC对羟自由基的IC50为0.04 mg/mL。当DZ-1与DZ-2质量浓度达到0.5 mg/mL后，羟自由基清除率的增长速率均趋于平缓，当质量浓度为1.0 mg/mL时，DZ-1与DZ-2的羟自由基清除率分别达到最大值43.05%、62.98%。
图6 DZ-1与DZ-2的羟自由基清除效果Fig.6 Hydroxyl radical scavenging effects of DZ-1 and DZ-2
2.4.3 ABTS阳离子自由基清除实验
ABTS阳离子自由基测定法也是一种评价天然化合物抗氧化能力的方法。多糖向不稳定的ABTS阳离子自由基提供一个电子和氢原子以形成稳定的ABTS自由基[23-27]。由图7可知，DZ-1与DZ-2对ABTS阳离子自由基的清除能力均表现出一定的量效关系，即随着质量浓度的升高而逐渐增强。其中，DZ-2对ABTS阳离子自由基的IC50为0.31 mg/mL，VC对ABTS阳离子自由基的IC50为0.05 mg/mL。DZ-1与DZ-2质量浓度1.0 mg/mL时，ABTS阳离子自由基清除率最大，分别为42.01%与61.47%。
图7 DZ-1与DZ-2的ABTS阳离子自由基清除效果Fig.7 ABTS cation radical scavenging effects of DZ-1 and DZ-2
大量研究报道已证实多糖具有一定的体外抗氧化作用[28-30]，综合以上实验结果可知，DZ-1与DZ-2 2 种植物乳杆菌胞外多糖均具备一定的自由基清除能力，且DZ-2总体抗氧化活性强于DZ-1。造成这种差异性的可能原因为DZ-2结构中含有更多带电荷基团，如糖醛酸、硫酸基等。至于植物乳杆菌胞外多糖抗氧化机理与多糖结构之间的关系有待进一步研究。
通过对植物乳杆菌胞外多糖采用水提醇沉方法得到粗多糖，粗多糖先后经除蛋白、脱色等处理后，再经阴离子DE-52交换柱色谱分离纯化最终得到DZ-1与DZ-2多糖组分，采用柱前衍生-GC法分析DZ-1与DZ-2中单糖的组成，DZ-1为由葡萄糖组成的均多糖，DZ-2则为由阿拉伯糖、半乳糖组成的杂多糖，其单糖组成及百分比含量比值为阿拉伯糖∶半乳糖=46.03∶53.89。体外抗氧化活性实验表明，DZ-1与DZ-2均具有一定的自由基清除能力，且DZ-2的抗氧化活性强于DZ-1，该结论表明植物乳杆菌胞外多糖具备被开发成天然抗氧化剂的前景，同时为植物乳杆菌在医学、化妆品及食品工业等领域的开发与利用提供参考。
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