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王庚新，张春玲，赵 伟，陈 露，邸铁涛，张 云，王艳辉，刘海艳
1.贵州中医药大学，贵州 550002；
2.贵州中医药大学第二附属医院
糖 尿 病 溃 疡（diabetic ulcers，DUs）是 糖 尿 病（diabetes mellitus，DM）的一种慢性并发症，属于慢性难愈性创面[1]。治疗不当会导致严重的残疾甚至死亡，使病人的生活质量恶化，造成巨大的经济和心理负担，对个人、家庭和社会造成严重威胁[2]。目前，组织工程产品、伤口敷料和伤口自体移植物等新的医疗辅助用品及治疗方法，在糖尿病溃疡的治疗方面取得了一定进展[3]。然而，高昂的治疗费用使其临床广泛应用受到限制。因此，积极探索新的治疗方案，补充现有的治疗策略，提高治疗效果，减轻病人的经济负担，是亟待解决的问题。近年来，中医药治疗糖尿病溃疡已被正式纳入《中国2 型糖尿病防治指南》和《中国糖尿病足防治指南》[4-5]。与西医相比，中医多成分、多靶点、多途径综合治疗糖尿病溃疡创面，具有毒副作用小、成本低的优点[6]。中药丹黄散是由丹参、大黄、当归、没药、沉香、松香几味药物组成的复方散剂，前期研究结果表明，丹黄散对于糖尿病溃疡创面有一定的促愈效果，能有效促进病人溃疡创面上皮生长覆盖，加速创面愈合，但具体作用机制尚不清楚[7]。细胞中的线粒体可以选择性地通过自我吞噬的方式将损伤或老化的线粒体清除，以维持细胞内环境稳态，保护细胞正常结构与功能，减少凋亡，又称线粒体自噬[8]。研究表明，高糖环境所致的血管内皮细胞损伤中，提升PINK1、Parkin 在血管中的表达水平，激活线粒体自噬，可以保护内皮细胞功能[9]。鉴于此，推测丹黄散能通过PINK1/Parkin 信号通路介导的线粒体自噬，维持创面细胞线粒体正常结构与功能，促进糖尿病溃疡创面愈合。本研究以PINK1/Parkin 通路介导的线粒体自噬为靶向，拟通过建立糖尿病溃疡小鼠模型来探讨丹黄散对糖尿病溃疡创面的促愈机制。
1.1 试剂、仪器 苏木精-伊红（HE）高清恒定染色液（批 号：BA4232）、Masson 三 色 染 色 液（批 号：BA4079A）、二喹啉甲酸法（BCA）蛋白定量试剂盒（批号：33267）均购自珠海贝索生物技术有限公司；
兔抗小鼠PINK1 单克隆抗体（批号：23274-1-AP）购自Proteintech 公司；
兔抗小鼠LC3 多克隆抗体（批号：4108S），购自Coll Signaling 公司；
兔抗小鼠β-actin 单克隆抗体（批号：AL1415），购自中杉金桥公司；
HHQ-1508R 轮转式切片机（杭州艾普仪器设备有限公司产品）；
光学显微镜（德国徕卡显微系统公司产品）；
凝胶成像分析仪（美国通用电气医疗公司产品）；
生物透射电镜（美国FEI 公司产品）。
1.2 实验动物 选择自发2型糖尿病C57BLKS/Jdb/db小鼠（db/db）18 只（db/db 为自发2 型糖尿病小鼠），雄性，鼠龄8～9 周，体重42～46 g，无特定病原体（SPF）级别；
同遗传背景的非糖尿病C57BLKS/Jdb/+小鼠（db/m）6 只（db/m 为同遗传背景的非糖尿病小鼠），鼠龄8 周，体重22～25 g，SPF 级别，均购自常州卡文斯实验动物有限公司，实验小鼠饲养于贵州医科大学动物中心SPF 级动物房，分笼喂养，自由摄食、摄水，房间内环境温湿度保持在20～25 ℃、40%～60%，光照12 h，黑暗12 h 循环饲养。本研究已通过医院伦理委员会审批，审批号为：PY2020063。
1.3 实验用药 丹黄散为贵州省某三级甲等医院科室专家经验方，黔药制字Z03100240。方中药物大黄、丹参、当归、沉香、松香、没药均由药剂科按照2020 年版《中国药典》标准进行采购，按照比例混合经苏畅超群30B 粉碎机物理粉碎后充分混匀，取得的中药粉末以能过120 目筛为宜，用60Co 辐照灭菌处理。重组人表皮生长因子凝胶（以下简称生长因子凝胶），国药准字S20020123，购自桂林华诺威基因药业有限责任公司，规格为每支10 g。
1.4 糖尿病溃疡模型制备 所有小鼠适应性喂养1 周后，使用4%水合氯醛按0.01 mL/g 的剂量给小鼠腹腔注射进行麻醉，使用剃毛器在小鼠背部剃毛备皮，大小为2.0 cm×2.0 cm，消毒背部皮肤后，在无菌操作下使用直径为0.8 cm 的打孔器在小鼠背部打孔，并在形成创面后的24 h 内用50%冰醋酸棉球刺激创口，观察受冰醋酸刺激后的创口出现坏死、创面溃疡特征时，则可认为糖尿病溃疡小鼠造模成功[10-11]。
1.5 分组 采用随机数字表法进行分组。以喂养db/db 笼子的序号1～18 作为编号，采用SPSS 软件创建18 个随机数，由小到大排序得序号N，规定每段随机排列序号N 对应处理组，N1～N6 为模型组、N7～N12 为生长因子组、N13～N18 为丹黄散组，6 只db/m 小鼠作为空白组。
1.6 创面给药方法 空白组和模型组不进行药物干预，用无菌生理盐水清理创面后用医用无菌纱布进行覆盖，医用胶布固定；
生长因子组和丹黄散组均以生理盐水清理创面后，分别用重组人表皮生长因子凝胶和丹黄散均匀地敷于伤口，1 层医用无菌纱布覆盖，医用胶布固定，敷药面积大于创面边缘1 mm，药物厚度约为2 mm。每日定时换药1 次，连续给药21 d[12]。
1.7 创面取材方法 分别在用药干预后第7 天、第14天取材，在无菌操作下剪取小鼠创面创缘组织，分别进行HE 染色、Masson 染色、透射电子显微镜观察和蛋白质免疫印迹（western-blot）检测。
1.8 观察指标与检测方法
1.8.1 创面愈合率 采用透明胶带描记法对造模后第7 天、第14 天、第21 天小鼠创面面积进行描摹，标尺标记，以Image-Pro-Plus 软件处理分析计算创面愈合率。愈合率=(原始创面面积—未愈合创面面积)÷原始创面面积×100%。
1.8.2 HE 染色 小鼠创缘组织用4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，5 μm 切片。染色：切片脱水后用苏木精染色5 min，在室温下用盐酸乙醇染色3 s。用自来水冲洗30 min 后恢复蓝色，用伊红染色液染色2 min。阿利新蓝染色时，切片用阿利新蓝染色20 min，后用0.5%高碘酸水溶液氧化10 min，用希夫试剂染色15 min。脱水、透明：70%乙醇10 s→95%乙醇10 s→100%乙醇10 s→二甲苯1、2 各5 min[13]。封片：中性树胶封固。采用多功能光学显微镜观察创面新生肉芽组织的病理结构。
1.8.3 Masson 染色 小鼠创缘组织用4%多聚甲醛固定24 h，组织切片方法同HE 染色。染色：用维格特铁苏木精染色5 min，用1%盐酸乙醇分化几秒钟后，用自来水冲洗30 min，切片变蓝。用紫红酸性品红溶液染色10 min，磷钼酸水溶液染色5 min 后，用苯胺蓝溶液复染色5 min，1%冰醋酸处理1 min。脱水、透明：90%乙醇3 min→95%乙醇5 min→无水乙醇5 min→二甲苯1、2 各5 min[14]。封片：中性树胶封固。
1.8.4 超细微结构观察 将小鼠部分创缘组织，固定于4%戊二醛中，保存于4 ℃冰箱内。24 h 后取出按照透射电镜切片流程进行锇酸溶液固定、乙醇脱水、包埋、超薄切片机切片、柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀双染色法染色，晾干后在透射电镜中观察[15]。
1.8.5 Western-Blot检测胞浆型自噬标志物（LC3-Ⅰ）、膜型自噬标志物（LC3-Ⅱ）、PINK1、Parkin 蛋白的表达水平 将小鼠部分创缘组织提取目标蛋白后进行BCA 蛋白浓度检测，配胶后电泳，转聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、加LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin、β-actin的一抗室温孵育2～3 h，放于 4 ℃冰箱，次日加二抗室温孵育2 h 后在室内使用 ECL 液多次与PVDF 膜正面接触后，曝光、洗片、拍摄扫描胶片，图像分析系统分析条带灰度值[16]。
1.9 统计学方法 采用SPSS 22.0 对数据进行分析，符合正态分布的定量资料以均数±标准差（±s）描述，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用最小显著差异法（least significant difference，LSD）。检验水准α=0.05，P＜0.05 为差异有统计学意义。
2.1 4 组创面愈合率比较（见表1）
表1 各组小鼠的创面愈合率比较（±s） 单位：%
表1 各组小鼠的创面愈合率比较（±s） 单位：%
① 与模型组比较，P＜0.05。
组别空白组模型组生长因子组丹黄散组F 值P第21 天92.840±1.727①72.070±1.333 96.210±2.254①98.140±1.791①266.265＜0.001样本数6666第7 天23.490±1.101①16.600±1.581 23.470±1.395①25.180±1.788①39.327＜0.001第14 天61.570±1.546①42.890±1.986 62.250±2.186①60.040±1.387①150.901＜0.001
2.2 创面组织HE 染色结果 研究显示，皮肤损伤第7 天～第14 天为创面修复高峰期，故对创面病理情况的研究选择术后第7 天和第14 天的组织。模型组：造模第7 天时可见许多炎症细胞浸润，细胞间质疏松，新生毛细血管稀少、肉芽组织较少；
第14 天时仍可见炎性细胞浸润，少量毛细血管形成，成纤维细胞较少，细胞间质较疏松，肉芽组织生成不足。空白组：造模第7天时可见炎症细胞浸润，细胞间质较为疏松，成纤维细胞、新生毛细血管生成数量多于模型组，可见少量肉芽组织，表皮开始覆盖创面；
第14 天时炎症反应减轻，成纤维细胞大量增加，细胞间排列紧密，新生肉芽组织形成明显增加，表皮覆盖创面面积较多。生长因子组和丹黄散组：造模第7 天时许多炎症细胞浸润，细胞间质较为疏松，成纤维细胞、新生毛细血管生成数量多于模型组，可见少量肉芽组织，表皮开始覆盖创面；
第14 天时炎症反应减轻，成纤维细胞大量增加，细胞间排列紧密，新生肉芽组织形成明显增加，表皮覆盖创面面积较多。见图1。
图1 4 组创面组织HE 染色
2.3 Masson 染色结果 模型组：造模第7 天时创面蓝染很浅，胶原纤维形成很少，组织基质疏松排列；
第14 天时创面蓝染仍然较浅，胶原纤维形成较少，组织基质疏松排列。空白组：造模第7 天时创面蓝染浅，胶原纤维形成少，组织基质较为疏松；
造模第14 天时创面组织蓝染深而多，胶原纤维丰富，组织基质紧密排列。生长因子组和丹黄散组：造模第7 天创面蓝染浅，胶原纤维形成少，组织较为疏松；
造模第14 天时创面蓝染深而较多，胶原纤维丰富，组织基质排列紧密。见图2。
图2 4 组创面组织Masson 染色
2.4 透射电镜观察创面组织超微结构 研究显示，创伤后第7 天为线粒体修复高峰期，故对线粒体的研究选择第7 天的组织。模型组：创面组织中线粒体呈椭圆形，发生肿胀，出现空泡化，脊突紊乱或消失，可见少量自噬小体吞噬受损线粒体。空白组：创面组织中线粒体大多呈线型，有部分轻微肿胀，可见自噬小体吞噬受损线粒体以及与溶酶体融合的受损线粒体。生长因子组和丹黄散组：创面组织中线粒体肿胀情况较轻，线粒体边缘不规则，可见自噬小体吞噬受损线粒体。见图3。
图3 4 组病人创面组织超细微结构
2.5 线粒体自噬相关蛋白的表达水平（见表2、 图4）
图4 小鼠创面LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、PINK1、Parkin 蛋白的表达水平
表2 小鼠创面组织蛋白的表达水平（±s）
表2 小鼠创面组织蛋白的表达水平（±s）
① 与模型组比较，P＜0.05。
组别空白组模型组生长因子组丹黄散组F 值P LC3Ⅱ/LC3Ⅰ0.678 3±0.013 1①0.509 0±0.007 8 0.696 4±0.028 1①0.727 3±0.020 9①131.291＜0.001样本数6666 PINK1 蛋白0.834 9±0.054 1①0.555 2±0.032 9 0.767 6±0.038 2①0.919 5±0.050 9①58.620＜0.001 Parkin 蛋白0.716 6±0.016 3①0.528 5±0.020 9 0.711 0±0.027 2①0.762 9±0.031 7①87.422＜0.001
糖尿病溃疡创面属于慢性难愈性创面，创面愈合是一个复杂的生物学过程。正常创面修复需要经历凝血期、炎症期、增殖期以及重塑期4 个阶段[17]。正常情况下这4 个阶段循序渐进，逐步进行。但在高糖环境下，创面各组成成分由于代谢紊乱、缺氧、缺失营养而受到不同程度的损害，导致创面炎症期延长，创面愈合延迟[18]。本研究结果显示，模型组第7 天时可见大量炎症细胞浸润，细胞间质疏松，新生毛细血管稀少，肉芽组织较少，胶原纤维形成很少；
第14 天时仍可见许多炎性细胞浸润，少量毛细血管形成，成纤维细胞较少，细胞间质较疏松，肉芽组织生成不足，胶原纤维形成较少。提示高糖环境导致创面炎症反应加重，向增殖期过度的时间延迟，成纤维细胞增殖减少，新生肉芽组织和血管生成减少。王安宇等[19]发现，丹黄散可以促进糖尿病溃疡创面愈合，取病人创面组织进行基因芯片检测，结果发现白介素-4、白介素-7、白介素-26 基因表达均下调，表明丹黄散干预后,炎症因子基因表达下调，炎症得以控制。课题组前期使用一种羟甲基壳聚糖制成的海绵负载丹黄散治疗糖尿病溃疡大鼠，Western-Blot 检测大鼠创面组织发现超敏C 反应蛋白、白介素-1、白介素-6 炎症因子表达下调，表明丹黄散制备的海绵可以减轻创面炎症反应，促进创面愈合[20]。丹黄散组第14 天时炎症反应减轻，成纤维细胞大量增加，细胞间排列紧密，新生肉芽组织形成明显增加，表皮覆盖创面面积较多，胶原纤维丰富，提示丹黄散有助于降低创面炎症因子的表达，减轻创面炎症反应，促进新生血管生长和肉芽组织的形成，加速创面愈合。
线粒体是细胞执行正常生物学功能重要的细胞物质基础，维护其基本结构和组织功能正常稳定运转对于保护细胞得以生存至关重要[21]。线粒体自噬是维持细胞内环境稳态的关键，其可维持线粒体数目及功能稳定，保证细胞功能正常执行[22]。异常线粒体能够释放大量活性氧和凋亡因子，并通过众多途径导致细胞损伤或凋亡。因此，线粒体自噬水平下降势必会破坏能量稳态[23]。目前，常用LC3-Ⅱ和LC3-Ⅰ蛋白表达比值评估自噬水平，LC3-Ⅱ和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加提示线粒体自噬水平提高[24]。调节线粒体自噬的分子途径有多种，PINK1/Parkin 通路便是其中之一，上调PINK1、Parkin 蛋白表达，可激活线粒体自噬。PINK1是存在于线粒体外膜的一种蛋白激酶，其在胞质中合成后通过线粒体膜分子通道进入线粒体内部，最终被线粒体内蛋白水解酶降解[25]。线粒体受损会导致内膜电位消散，PINK1 跨越外膜向内膜转移受阻，避免其被蛋白水解酶降解，最终稳定并积累在线粒体外膜上，从而激活存在于细胞浆中的E3 泛素酶Parkin[26]。本研究结果显示，模型组小鼠创面组织发生肿胀，出现空泡化，脊突紊乱或消失，电镜可见少量自噬小体吞噬受损线粒体，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、PINK1、Parkin 的蛋白表达均明显低于其他组别（P＜0.05），表明高糖环境可能导致细胞线粒体结构和功能受损严重，线粒体自噬水平较低。丹黄散组线粒体肿胀情况较轻，可见自噬小体吞噬受损线粒体，创面组织中的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、PINK1、Parkin 蛋白表达均高于模型组，表明丹黄散可上调小鼠创面组织LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、PINK1、Parkin 蛋白表达，激活线粒体自噬功能，保护创面细胞线粒体的正常结构和功能。
本研究建立糖尿病溃疡小鼠模型探讨丹黄散促进糖尿病溃疡创面愈合的相关机制，发现丹黄散可减轻创面炎症反应，促使创面由炎症期向增殖期发展，上调PINK1、Parkin 蛋白的表达，激活线粒体自噬保护创面细胞结构及生理功能完整，利于损伤血管修复、重构和肉芽组织的生长，有效促进糖尿病小鼠溃疡创面愈合。本研究选用的通路上下游因子众多，可以进一步深入开展研究，特别是对于上层基因、下层蛋白的影响可以深入探讨，以在今后的工作中进一步开展。
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