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孙春燕 高颖 程发峰 王雪茜 徐甜 刘凤智 徐文秀 张泽涵 王庆国
血管性痴呆(vascular dementia,VD)是各种脑血管因素导致的脑组织受损引起的以学习、记忆、计算、定向等认知功能减退为特征的临床综合征。随着脑血管病发病率的升高,VD 成为最常见的痴呆类型之一,约占痴呆总比例的15%[1]。
VD 严重影响患者的精神健康及生活质量,给社会和家庭带来沉重的负担。
VD 早期具有可逆性,但目前缺乏有效的治疗手段或者药物。
治疗性血管新生通过血管新生和血管重塑来增加供血,改善缺血缺氧损伤[2],为VD 的治疗提供新思路、新方法。
本课题组认为浊毒在VD 的发生发展过程中发挥重要作用[3],基于丰富的临床经验及实验数据,以清开灵及精制清开灵注射液为原型,在现代医学理论指导下化裁得到由黄芩、栀子和猪胆粉三种药物组成的新药—芩栀猪胆方。
该方具有清热化痰、解毒通络功效,长期小剂量服用,可以解除清窍中的痰热瘀毒,起到以清代补的功效。
本研究以改良双侧颈总动脉永久结扎(permanent occlusion of bilateral common carotid,2-VO)大鼠模型为研究对象,以微血管密度、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)蛋白及基因为检测指标,通过苏木素—伊红染色(Hemotaxylin-eosin staining,HE)、免疫组织化学染色、实时荧光定量PCR(quantative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)等方法,探究芩栀猪胆方对VD 大鼠血管新生的影响及其潜在作用机制,为芩栀猪胆方治疗VD 的进一步研究奠定基础。
1.1 实验动物
24 只 SPF 级健康雄性 Wistar 大鼠,体质量200 ~220 g,购买于北京维通利华实验动物有限公司[动物许可证编号:SYXK(京)2020-0033]。
饲养于北京中医药大学SPF 级实验动物房。
设置室温25℃,相对湿度65% ~70%,光照周期昼夜各12 小时,自由饮水、饮食。
适应性饲养1 周。
1.2 药材及制备方法
芩栀猪胆方由黄芩(安国市安兴中药饮片有限公司,货号:200901)、栀子(安国市安兴中药饮片有限公司,货号:200801)、猪胆粉(安国市盛泰中药饮片有限公司,货号:190901)组成。
栀子采用乙醇冷浸法提取,醇提法出膏率为16.7%;黄芩按照碱溶酸沉法提取,其出膏率为11%。
按照黄芩、栀子、猪胆粉生药配比10 ∶6 ∶1.5 称取各成分,各成分中分别加入20 倍纯水,在超声中缓慢加入10%NaOH 至各成分全部溶解(PH 值不超过9),得到溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ;将3 种溶液混合,缓慢滴加10%NaOH 调整PH值至预定值;在溶液中加入0.3%活性炭,加热煮沸15 分钟,精滤,再次滴加10%NaOH 调整PH 值至预定值,加水至刻度,灌装后沸水浴灭菌1 小时。
1.3 主要药品与试剂
尼莫地平片(亚宝药业集团股份有限公司,国药准字: H14022821, 20 mg), 氯化钠注射液(NEWPROBE,货号:PB30164),4%多聚甲醛固定液(艾旗,货号:S1013),戊巴比妥钠(购于苏州坤宸生物医药有限公司),氨苄青霉素三水物(bioruler,货号:RH30261-5g),兔 SP Kit(中杉金桥,货号:SP-9001),PBS 缓冲液(中杉金桥,货号:ZLI-9062),VEGFA 抗体(Proteintech 公司,货号:19003-1),CD34 抗体(Abcam 公司,货号:ab81289),VEGFR2抗体(Abcam 公司,货号:ab39638),RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific,货号:K1622),组织细胞RNA 小量提取试剂盒(MAGEN美基,货号:R4111-02),iTaq Univer SYBR Green Supermix 1000 Rxn(BIO-rad,货号:1725122)。
1.4 主要仪器
Morris 水迷宫视频分析系统(北京中医药大学实验中心提供),包埋机(德国Leica,EG1160),转式石蜡切片机型(德国Leica,RM2235),冷冻离心机(Eppdendorf,5424R),C1000 TouchTMThermal Cycler PCR 仪(BIO-rad,1851148),荧光定量 PCR 仪(BIO-rad, CFX96TMReal-Time System), 高倍显微镜(OLYMPUS,BX60),图像采集系统(美国Diagnostic Instrument,SPOTFLEX)。
1.5 分组、造模及给药
将大鼠按照随机数字法随机分为4 组:空白对照组、模型组、芩栀猪胆组和尼莫地平组,每组6 只。除空白对照组外,其余大鼠术前禁食12 小时,自由饮水,腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉。
采用改良双侧颈总动脉永久性结扎法复制VD 模型。
仰卧固定大鼠,备皮消毒后沿颈部正中逐层剪开,钝性分离,用手术线结扎右侧颈总动脉阻断血流,手术线缝合皮肤。
1 周后以同样的方式结扎左侧颈总动脉。
术后连续三天注射青霉素钠注射液0.1 mL 抗感染。
动物苏醒后出现同侧眼睑下垂、眼裂变小表明造模成功。
造模成功后第二天开始干预。
根据文献[4-5]描述,按照成人用药剂量,换算芩栀猪胆组大鼠给药量为31.25 mg/kg;尼莫地平组:根据成人用药剂量,换算为62.5 mg/kg,用去离子水按照给药体积为3 mL/kg 的比例配置为混合溶液。
空白对照组及模型组给予等体积的去离子水灌胃。
各组每日干预1 次,每周根据动物体重变化调整给药剂量,持续4 周。
1.6 行为学评价
采用Morris 水迷宫试验。
水迷宫装置包括直径150 cm、高60 cm 的圆形水池、逃避平台和视频定位仪器。
每天由固定人员在固定时间进行测试,实验过程中保持室内安静,避免周围光源及噪音的干扰。
(1)定位航行实验:将大鼠面向池壁分别从4个象限放入水中,自由探索游泳,计时120 秒,记录其寻找隐藏在水下平台的时间,即逃避潜伏期,若超过120 秒未找到平台,逃避潜伏期记为120 秒。连续训练4 天。
(2)空间探索试验:第5 日撤去水池中平台,将大鼠从原平台对侧象限放入水池,记录其在120 秒内穿越原平台的次数。
1.7 HE 染色观察大鼠脑组织病理学变化
腹腔麻醉后开胸暴露心脏,将灌注针插入心尖,剪开右心耳,依次迅速灌注0.9%生理盐水、4%多聚甲醛各200 mL,至流出液无血色、四肢及颈部僵硬时停止灌注。
后迅速取脑,将新鲜脑组织放入4%多聚甲醛中固定1 周。
常规脱水、透明,石蜡包埋,连续切片,切片厚4 μm。
HE 染色,显微镜进行图像采集。
1.8 免疫组织化学染色检测 CD34、VEGFA、VEGFR2 表达水平
按照免疫组化试剂盒步骤进行染色。
微血管密度测定参照WEIDNER 法,不论有无血管管腔,单个独立阳性染色内皮细胞或多个阳性染色内皮细胞紧密排列均为一个血管计数。
以细胞膜或胞浆内呈现棕黄色颗粒为VEGFA、VEGFR2 阳性。
每组3 只大鼠,随机选取2 ~3 张切片,每例标本随机选取5 个不同视野,计算每只大鼠平均值。
1.9 qRT-PCR 检测 VEGFA、VEGFR2 mRNA 含量
(1)脑标本采集:将每组剩余3 只大鼠麻醉抽血后迅速断头取脑,在冰上解剖出海马组织,迅速放入冻存管中,并转移至液氮中保存备用。
(2)组织总RNA 的提取:取30 mg 海马组织提取总RNA,取A260/A280≥1.8。
(3)cDNA 合成:按照逆转录试剂盒步骤操作。
(4)mRNA 合成引物序列。
(5)mRNA 检测:qRT-PCR System CFX96 RT-qPCR 反应条件:预变性(95℃,30 秒),40 个循环变性(95℃,30 秒),退火(60℃,30 秒),以 GAPDH 为内参,以公式2-ΔΔCt计算mRNA 相对表达量。
引物序列具体见表1。
表1 引物序列
1.10 统计学处理
应用SPSS 25.0 软件进行统计分析,实验中计量资料均符合正态分布,方差齐,以均值±标准差()表示,数据采用单因素分差分析进行比较,以P<0.05 为差异有统计学意义。
2.1 大鼠学习记忆能力比较
2.1.1 逃避潜伏期比较 随着训练天数的延长,各组大鼠逃避潜伏期逐渐减少,并趋于稳定。
与空白对照组比较,模型组大鼠逃避潜伏期均增加(P<0.05),芩栀猪胆组、尼莫地平组与其比较无明显差异。
与模型组比较,芩栀猪胆组与尼莫地平组逃避潜伏期均缩短(P<0.05);芩栀猪胆组与尼莫地平组之间逃避潜伏期无明显差异。
见表2。
表2 各组VD 大鼠逃避潜伏期比较(,n=6,秒)
表2 各组VD 大鼠逃避潜伏期比较(,n=6,秒)
注: 同一时间节点,与空白对照组比较,aP<0.05,bP<0.01;与模型组比较,cP<0.05,dP<0.01。
组别 第一天 第二天 第三天 第四天空白对照组 61.58±49.20 42.08±37.98 27.29±22.89 20.96±12.90模型组 98.13±34.21a 79.54±39.76b 56.38±43.54b 47.79±44.72b芩栀猪胆组 63.67±36.93c 45.54±36.59c 28.25±18.01d 22.71±21.65c尼莫地平组 63.58±48.16c 45.96±39.05c 29.67±21.65d 21.92±20.07d
2.1.2 穿越平台次数比较 与空白对照组比较,模型组大鼠穿越平台次数减少(P<0.01),芩栀猪胆组、尼莫地平组与其比较无明显差异。
与模型组比较,芩栀猪胆组与尼莫地平组穿越平台次数增加(P<0.05)。
芩栀猪胆组与尼莫地平组之间穿越平台次数比较无明显差异(P>0.05)。
见表3。
表3 各组VD 大鼠穿越平台次数比较(,次)
表3 各组VD 大鼠穿越平台次数比较(,次)
注: 与空白对照组比较,aP<0.01;与模型组比较,bP<0.05,cP<0.01。
组别 鼠只 穿越平台次数空白对照组 6 3.00±1.26c模型组 6 0.83±0.75a芩栀猪胆组 6 2.83±1.47b尼莫地平组 6 2.50±1.38b
2.2 大鼠海马CA1 区病理形态比较
空白对照组大鼠海马CA1 区细胞排列规整,细胞核清晰可见,形状近似圆形,细胞核和细胞浆对比鲜明;模型组大鼠海马CA1 区细胞排列紊乱,数量减少,变性坏死细胞较多,神经元锥体细胞核出现固缩、破裂、溶解;芩栀猪胆组和尼莫地平组大鼠海马CA1 区细胞结构较为清晰,神经元凋亡、坏死现象较模型组明显减轻。
如图1 所示。
图1 大鼠海马CA1 区HE 染色(×400)
2.3 大鼠海马CA1 区微血管密度比较
与空白对照组比较,模型组大鼠微血管密度增加(P<0.01),芩栀猪胆组及尼莫地平组微血管密度均明显增加(P<0.01)。
与模型组比较,芩栀猪胆组与尼莫地平组大鼠微血管密度明显增加(P<0.01)。芩栀猪胆组与尼莫地平组大鼠微血管密度无明显差异(P>0.05)。
见表4,图2。
图2 大鼠海马CA1 区CD34 免疫组化染色(×400)
表4 各组VD 大鼠海马CA1 区微血管密度比较(,个)
表4 各组VD 大鼠海马CA1 区微血管密度比较(,个)
注: 与空白对照组比较,aP<0.01;与模型组比较,bP<0.01。
组别 鼠只 微血管密度空白对照组8.40±1.77模型组 3 11.53±0.55a芩栀猪胆组 3 17.57±1.40ab尼莫地平组 3 16.77±1.27 3 ab
2.4 大鼠海马CA1 区VEGFA、VEGFR2 表达水平比较
与空白对照组比较,模型组、芩栀猪胆组和尼莫地平组大鼠 VEGFA、VEGFR2 表达水平增加(P<0.05)。
与模型组比较,芩栀猪胆组与尼莫地平组VEGFA、VEGFR2 表达水平明显增加(P<0.05)。芩栀猪胆组与尼莫地平组VEGFA、VEGFR2 表达水平无明显差异(P>0.05)。
见表5,图3、4。
图3 大鼠海马CA1 区VEGFA 免疫组化染色(×400)
表5 各组VD 大鼠海马CA1 区VEGFA、VEGFR2表达水平比较(,个)
表5 各组VD 大鼠海马CA1 区VEGFA、VEGFR2表达水平比较(,个)
注: 与空白对照组比较,aP<0.05,bP<0.01;与模型组比较,c P<0.05,dP<0.01。
VEGFA VEGFR2空白对照组组别 鼠只3 54.70±3.80 12.57±0.76模型组 3 67.90±1.08a 16.47±0.97b芩栀猪胆组 3 86.30±11.30bd 21.43±0.51bd尼莫地平组 3 81.97±3.09bc 20.90±1.95bd
2.5 大鼠海马组织VEGFA、VEGFR2 mRNA 水平比较
与空白对照组比较,模型组大鼠 VEGFA、VEGFR2 mRNA 水平无明显差异,但存在升高趋势(P>0.05);芩栀猪胆组及尼莫地平组大鼠VEGFA、VEGFR2 mRNA 水平明显增加(P<0.01)。
与模型组比较,芩栀猪胆组与尼莫地平组大鼠VEGFA、VEGFR2 mRNA 水平明显增加(P<0.01)。
芩栀猪胆组与尼莫地平组大鼠VEGFA、VEGFR2 mRNA 水平无明显差异(P>0.05)。
见表6。
图4 大鼠海马CA1 区VEGFR2 免疫组化染色(×400)
表6 各组VD 大鼠海马组织VEGFA、VEGFR2 mRNA水平比较()
表6 各组VD 大鼠海马组织VEGFA、VEGFR2 mRNA水平比较()
注: 与空白对照组比较,aP<0.01;与模型组比较,bP<0.01。
VEGFA mRNA VEGFR2 mRNA空白对照组组别 鼠只3 0.75±0.13 0.74±0.00模型组 3 0.95±0.04 1.02±0.04芩栀猪胆组 3 1.33±0.15ab 1.54±0.05ab尼莫地平组 3 1.34±0.19ab 1.63±0.34ab
“毒损脑络”为VD 的核心病机,浊毒为害是血管性痴呆发生、发展的关键[3,6-7]。
“毒”是因脏腑功能和气血运行失常使体内的生理和病理产物不能及时排出,蕴积体内过多形成,包括痰毒、瘀毒、热毒等。
痰热瘀毒三者互为因果,相互转化,相互为患。
解毒以祛除致病因素,通络以畅通气血对脑络的渗灌,使神机恢复,是VD 治疗的关键所在。
针对VD 的治疗,本团队主张慢病缓调,清热类中药小剂量长期服用,解除清窍中的热毒;VD 病理性质为本虚标实,痰、热、毒邪进一步耗损正气,清热化痰开窍又可以起到以清代补的功效。
研究发现,黄连解毒汤可以增加脑血流量,尤其是增加缺血边缘处的血流量,改善VD 患者的临床症状[3]。清开灵注射液能增加脑灌注,明显改善VD 患者认知水平[8]。
精制清开灵注射液能够上调慢性缺血损伤大鼠海马组织中神经生长因子的表达,改善慢性缺血缺氧损伤,提高认知记忆能力[9]。
基于对临床需要和药物疗效的分析和权衡,课题组在前期研究成果精制清开灵注射液的基础上化裁得到治疗VD 的方剂——芩栀猪胆方,药物主要包括黄芩、栀子和猪胆粉,三药共奏清热化痰解毒通络的功效。研究表明,芩栀猪胆方可以调节脑内Treg 与Th17细胞的拮抗作用,调动外周免疫系统,减轻中枢神经系统内炎症反应,改善血流动力学指标,改善大鼠的学习记忆能力[4-5]。
Morris 水迷宫主要由定位航行实验和空间探索试验两部分组成。
定位航行实验中强迫大鼠游泳,大鼠通过视觉线索,学习并找到藏匿于水下固定位置的平台;多次反复实验不断加深大鼠对于空间和路线的记忆,测试大鼠的学习能力。
空间探索试验观察撤去水下固定平台后,大鼠对原平台位置区域的探索,以评估大鼠记忆能力[10-11]。
本研究发现,芩栀猪胆组大鼠与模型组比较,定位航行实验中逃避潜伏期明显缩短,空间探索试验中穿越平台次数明显增加,证明芩栀猪胆方可以改善VD 大鼠的记忆学习能力。
VD 的特点是由于大脑的血流量减少,导致脑细胞缺血、缺氧。
海马是人类学习记忆的关键部位,同时也是对脑缺血的敏感区域。
短暂性脑缺血即可造成海马区神经元不可逆性结构损伤[12]。HÖCKEL M 等[13]首创治疗性血管新生理论,在缺血缺氧等情况下以治疗手段促进血管新生,发挥修复血管损伤作用,通过血管新生和血管重塑来增加供血,改善缺血缺氧损伤[2]。
研究表明,脑缺血发生后,海马区微血管的增生可以改善海马区微循环及周围组织的血氧含量[12]、减轻白质[14]和神经元[15]损伤、增加神经元数量[16],促进神经功能恢复,从而提高学习记忆能力。
微血管密度是衡量血管新生的重要指标。CD34 是高度糖基化的跨膜糖蛋白,能较好的表达于分化早期的血管内皮细胞,在新生血管内皮中表达率明显高于成熟血管内皮。
因此,将CD34 作为新生血管内皮细胞的表达标志[17]。
实验结果显示,模型组比空白对照组微血管密度增加,表明脑缺血可以诱导血管新生,但是这种诱导能力相对有限。芩栀猪胆组和尼莫地平组微血管密度较模型组和空白对照组均明显增加,差异有统计学意义,表明芩栀猪胆方可以促进VD 大鼠海马组织血管新生。
血管内皮生长因子是目前研究最清楚、作用最明确的促进血管生长的因子[18]。
VEGF 作用于血管内皮细胞、神经元、巨噬细胞等,可以促进缺血区血流灌注、保护缺血神经元、促进神经发生和神经突再生等,被广泛地应用于缺血性脑血管病的研究中[19]。
如今VEGF 基本泛指VEGF-A,其在组织和细胞中含量最丰富,是VEGF 家族中促内皮细胞分化和血管新生作用最强的因子[19-20]。
VEGF 有三类受 体, 即 VEGFR1、 VEGFR2、 VEGFR3。
VEGF/VEGFR2 激活的信号级联反应是VEGF 信号通路的主要生物学效应,可以诱导血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成,促进血管新生[21]。
本试验结果显示,VEGFA 在神经元和血管内皮细胞均有表达。
芩栀猪胆组大鼠海马组织VEGFA、VEGFR2 蛋白表达较模型组明显升高,与阳性对照药尼莫地平无明显差异。
基因水平上,芩栀猪胆组大鼠海马组织VEGFA、VEGFR2 mRNA 水平升高,与空白对照组、模型组存在明显统计学差异。
综上所述,芩栀猪胆方可以提高VD 大鼠学习记忆能力,其机制可能与提高海马组织VEGFA、VEGFR2 蛋白及mRNA 水平,促进血管新生有关。芩栀猪胆方组方精简,实验研究证实有效,临床应用价值较高,但仍需多中心随机对照临床研究数据和更深层次的机制及药物成分研究以提供广泛的循证医学证据。
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