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赵甜甜，杨宁宁，宋新强
(信阳师范学院 生命科学学院，河南 信阳 464000)
钩藤，为茜草科植物钩藤(Uncariarhynchophylla)及其同属植物华钩藤(U.sinensis)、毛钩藤(U.hirsute)等的干燥带钩茎枝[1]。性凉，味甘，具有息风定惊、清热平肝的功效[2]。现代药理学表明其具有降压[3]、镇静[4]、镇痛[5]、和抗氧化[6]等药理作用，用于治疗高血压、头痛眩晕、阿尔茨海默等疾病[7]。钩藤中的化学成分主要包括生物碱、萜类、和黄酮等。钩藤碱和异钩藤碱是其最具代表性的药理活性成分[8]。有研究发现从钩藤中分离出的儿茶素具有对抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)[9]。但是，目前关于钩藤总黄酮的研究甚少，本实验以钩藤总黄酮含量为评价指标，采用单因素筛选、正交试验法优化乙醇加热回流法提取钩藤总黄酮的工艺条件,为充分开发钩藤药用价值提供依据。
1.1 材料
钩藤购于四川新荷花中药饮片股份有限公司；
亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠，均购自成都市科龙化工试剂厂；
芦丁对照品(成都曼思特有限公司，批号：MUST-16111111)。所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器
紫外分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；
数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；
电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)。
2.1 对照品溶液的制备
精密称取芦丁对照品5 mg，置于25mL容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并定容至刻度线，即得0.2 mg/mL的芦丁标准储备液。
2.2 标准曲线的制备
精密吸取芦丁对照品溶液0，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mL，分别置于10mL容量瓶中，加纯水2mL，加入5%的NaNO2溶液0.3mL，混匀，静置6min，然后加入10%的AL(NO3)3试剂0.3mL,混匀，静置6min，再加入4%的NaOH试剂4mL，加入纯水定容至刻度线后摇匀，静置15min。于波长510nm处测定吸光度。以溶液溶度(mg/mL)为横坐标，以吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程：A=11.24C-0.0214(R2=0.9961)，在0.0207～0.0611mg/mL范围内线性关系良好。
2.3 总黄酮含量的测定
取钩藤提取液适量，并稀释至10mL，精密吸取2 mL，按“2.2”项下方法进行显色，于510nm波长处测定供试品溶液的吸光度，据回归方程计算黄酮得率。
3.1 提取方法的比较
查阅相关文献，结合生产常用提取方法,分别考察水煎煮、乙醇超声提取、乙醇加热回流提取3种提取方法。①水煎煮提取：取钩藤粗粉1g，加入30倍水，80℃提取30min，提取1次，过滤，于100mL容量瓶中定容。②乙醇超声提取：取钩藤粗粉1g，加30倍60%乙醇，温度30℃，350W超声提取30min，提取1次，过滤，于100mL容量瓶中定容。③乙醇加热回流提取：取钩藤粗粉1g，用30倍60%乙醇，80℃加热回流提取30min，提取1次，过滤，于100mL容量瓶中定容。
按“2.3”项下方法进行总黄酮含量测定，计算黄酮得率。结果见表1。结果表明乙醇加热回流提取效果最好，明显优于水煎煮提取和乙醇超声提取法，所以选择乙醇加热回流提取。
表1 不同提取方法的比较
3.2 单因素考察
3.2.1 溶剂用量对总黄酮提取效率的影响
取钩藤药材1g，设置提取时间为30min，提取温度为50 ℃，以60%的乙醇溶液作为提取溶剂，考察溶剂用量分别为20,30,40,50,60倍时对钩藤总黄酮提取率的影响。如下图1所示。
图1 溶剂用量对总黄酮提取效率的影响
3.2.2 乙醇浓度对总黄酮提取效率的影响
取钩藤药材1g，设置提取时间为30min，提取温度为50 ℃，溶剂用量为50倍，考察乙醇浓度分别为40%,50%,60%,70%,80%时对钩藤总黄酮提取率的影响。如下图2所示。
图2 乙醇浓度对总黄酮提取效率的影响
3.2.3 提取时间对总黄酮提取效率的影响
取钩藤药材1g，设置提取温度为50 ℃，溶剂用量为50倍，以50%的乙醇溶液作为提取溶剂，考察提取时间30,40,50,60,70min对钩藤总黄酮提取率的影响。如下图3所示。
图3 提取时间对总黄酮提取效率的影响
3.2.4 提取温度对总黄酮提取效率的影响
取钩藤药材1g，设置提取时间为60min，溶剂用量为50倍，以50%的乙醇溶液作为提取溶剂，考察提取温度为50,60,70,80,90℃时对钩藤总黄酮提取率的影响。如下图4所示。
图4 提取温度对总黄酮提取效率的影响
由图1可知，随着溶剂用量的不断增加，钩藤总黄酮的提取率先增加后减少。当溶剂用量达到50倍时，提取率最高；
当溶剂用量高于50倍时，总黄酮提取率迅速下降，因此，选择50倍乙醇作为提取溶剂量最为合适。
由图2可知，随着乙醇浓度的不断增加，钩藤总黄酮的提取率先增加后减少。当乙醇浓度达到50%时，提取率最高；
当乙醇浓度高于50%时，总黄酮提取率反而下降，可能是因为高浓度的乙醇溶液会抑制黄酮的溶出。因此，选择50%乙醇作为提取溶剂最为合适。
由图3可知，随着提取时间的不断增加，钩藤总黄酮的提取率先增加后减少。当提取时间达到60 min时，提取率最高；
当提取时间高于60 min时，总黄酮提取率反而下降，可能是因为随着提取时间的延长，部分总黄酮会受到破坏而分解。因此，选择60 min作为提取溶剂最为合适。
由图4可知，随着提取温度的不断增加，钩藤总黄酮的提取率先增加后减少。当提取温度达到80℃时，提取率最高；
当提取温度高于80℃时，总黄酮提取率反而下降。可能是因为随着温度的升高，分子的热运动加快，随之提取率增加，温度升高至80℃时，过多的杂质会溶解出来，影响提取效果。因此，选择80℃作为提取溶剂最为合适。
3.3 正交设计
在前期单因素试验基础上,以乙醇浓度(A)、溶剂用量(B)、提取时间(C)、提取温度(D)为影响因素,以总黄酮提取率为评价指标，采用四因素三水平L9(34)进行正交试验设计。因素与水平见表2,试验安排与结果见表3，方差分析结果见表4。
表2 正交试验因素水平表
表3 正交试验结果
表4 正交试验方差分析结果
由表3正交试验结果分析可知，影响钩藤总黄酮提取效率因素的强弱顺序为：D>B>C>A，即提取温度>溶剂用量>提取时间>乙醇浓度。说明提取温度对钩藤总黄酮的提取率的影响最大，乙醇浓度对钩藤总黄酮提取率的影响最小。
根据表4方差分析结果可知，D(提取温度)对总黄酮得提取率影响显著(p<0.05)，溶剂用量、提取时间和乙醇浓度影响均不显著。所以最佳提取工艺条件为A1B3C3D3，即乙醇浓度40%，溶剂用量50倍，提取时间70min，提取温度90℃。
3.4 验证试验
按照上述试验得到的最佳提取工艺条件,平行进行3次提取试验,测得钩藤总黄酮的提取率分别为9.156%，9.244%，9.482%，3次测定的平均值为9.294%。表明该工艺稳定可行。
本文筛选出钩藤的最佳提取工艺为乙醇加热回流提取法。通过乙醇加热回流提取法的工艺优化，优选出钩藤总黄酮的最佳提取工艺，即在温度为90 ℃时加入50倍乙醇，提取70min可使钩藤总黄酮的提取率达到9.294%。
乙醇回流提取法相对于水煎煮和超声提取来说，操作简单，设备要求低、成本低廉，且提取效率最高。同时溶剂能循环使用,整个提取过程中没有任何污染。
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