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高倩 王建宇 孟伟建 李静 崔永健 魏琰 (衡水市人民医院神经内二科，河北 衡水 053000)
脑血管病危害身体健康，发病率、致残、致死率及复发率均较高〔1〕。脑梗死是脑血管病的一种，随着老龄人口占比的增加，老龄脑梗死的发病率逐年上升〔2〕。人参皂苷Rg1是人参、三七、绞股蓝等多种中药的重要有效单体成分，其功能具有抗氧化、抗衰老及减轻神经功能损伤，作为中药复方要以已广泛应用与脑血管疾病中〔3〕。人参皂苷Rg1具有一定的神经保护及抗凋亡作用，但其机制尚不明确〔4〕。轴突导向蛋白(Sema)4D可诱导炎性细胞激活，破坏内皮功能在中枢神经系统疾病中，人参皂苷Rg1在脑梗死中的应用及对神经功能的保护作用尚不清晰〔5〕。本研究对老龄脑梗死模型大鼠应用人参皂苷Rg1进行干预，探究其对梗死大鼠神经功能及Sema4D/神经丛蛋白B1抗体(Plexin B1)信号通路的作用。
1.1材料 选取清洁、健康的成年雄性SD大鼠30只，体重222～260 g，平均体重(228.95±18.05)g，15～20月龄，均由河北医科大学实验动物中心提供，许可证：SCXK(冀)2013-1-003，所有大鼠统一饲养，喂食标准鼠粮及清洁饮用水。
1.2方法
1.2.1大鼠梗死模型的制备〔6〕30只大鼠随机选取6只作为空白组，其余大鼠采用在显微镜下利用烧灼的方法制备大鼠梗死模型。将大鼠固定，用三溴乙醇腹腔注射麻醉，大鼠取仰卧位，固定四肢及头部，消毒，于颈部切1 cm口，分离肌肉组织，暴露并结扎右侧颈总动脉，缝合皮肤。取左侧卧位，剪开右侧外眦与耳屏之间约0.5 cm皮肤，暴露颞肌，剪开颞肌，暴露颅骨，钻开1 mm的小洞，确保脑组织不被损伤，烧灼大脑中动脉皮层支主干。显微镜观察，若烧灼位置未出现复流，则血管烧灼成功，缝合伤口。放置在低温37℃下，大鼠醒后给予预先准备的食物。脑梗死模型大鼠制备成功：大鼠因疼痛左侧肢体回缩，但反应迟钝或消失，倒悬时左上肢屈曲；
行走时身体向左侧倾倒或转圈。
1.2.2分组及干预 将造模成功的24只模型大鼠随机分为模型组和高、中、低人参皂苷组，大鼠于造模成功后24 h进行腹腔注射预先配置好的人参皂苷Rg1溶液(购自吉林大学有机化学教研室)及同体积生理盐水，1次/d，连续注射15 d。高、中、低剂量人参皂苷Rg1组：40、20、10 mg/kg人参皂苷，模型组、空白组：等量生理盐水。
1.2.3测定脑梗死面积 距最后一次干预24 h后大鼠断头取脑，取出两侧大脑半球，放入冰箱20 min，制作2 mm脑组织切片。37℃避光的条件下，染色，多聚甲醛固定。梗死部分为灰白色，正常部分为亮红色。对脑切片拍照、保存。分析脑组织缺血病灶，将脑梗死面积加和，计算全脑梗死面积。
1.2.4神经功能评分 无神经损伤为0分；
不完全伸展对侧前爪为1分；
向对侧转圈为2分；
向对侧倾倒为3分；
不能自发行走，无意识为4分。
1.2.5神经元特异性烯醇化酶(NSE)、Glu和Asp水平检测 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测NSE水平：提取标本包被液，对NSE 0.1 ml进行适当稀释，进而加到聚苯乙烯反应板各孔中。加盖4℃ 24 h保存。次日使用洗涤液进行3次全方位洗涤，甩干；
各孔内加不同稀释倍数的待检标本0.1 ml，同时增加阳性和阴性对照，置于43℃温箱60 min，移去液体。同上述法则洗涤3次，甩干；
孔内加稀释神经生长因子(NGF)0.1 ml，置43℃温箱60 min。移去液体，同前法洗3次，甩干；
各孔加底物液0.1 ml，置黑暗处20 min；
各孔内加2 mol的NGF 0.05 ml，终止反应。ELISA试剂盒(上海联祖生物科技有限公司，规格：48T/96T，型号：LZ-R6696)，试验操作严格根据说明书步骤进行。以高效液相色谱法学进行谷氨酸(Glu)和天冬氨酸(ASP)含量测定。
1.2.6病理学检查 大鼠大脑脑组织切片，4%甲醛固定，脱水，切片，苏木素-伊红(HE)染色。光镜下观察病理学变化。
1.2.7Sema4D、Plexin-B1检测 采用Western印迹检测Sema4D、Plexin-B1。将脑组织12 000 r/min离心15 min,得到脑组织上清液，将得到标本提取液取各组大鼠组织，根据总蛋白体取试剂盒提取血清蛋白质浓度。行电泳分离蛋白。洗膜10 min，共3次，分别用Sema4D、Plexin-B1的Ⅰ抗按比例4℃孵育过夜，洗膜3次，加入大鼠抗兔孵育2 h，最后洗膜3×10 min，重复试验5次，进行显色，曝光，结果以目的条带β-actin进行分析。
1.3统计学处理 采用SPSS26.0软件进行齐性方差分析、独立样本t检验。
2.1大鼠脑梗死面积及神经功能评分 如表1所示，与空白组相比，模型组、中、低、高剂量人参皂苷Rg1组脑梗死面积、神经功能评分水平显著较高(P<0.05)。与模型组相比，中、低、高剂量人参皂苷Rg1组脑梗死面积、神经功能评分水平显著较低(P<0.05)。与高剂量人参皂苷Rg1组相比，中、低人参皂苷Rg1组脑梗死面积、神经功能评分水平显著较高(P<0.05)。与低剂量人参皂苷Rg1组相比，中剂量人参皂苷Rg1组脑梗死面积、神经功能评分水平显著较低(P<0.05)。
2.2人参皂苷Rg1对脑组织Glu、NSE、Asp含量的影响 如表1所示，与空白组相比，模型组、中、低、高剂量人参皂苷Rg1组GLU、NSE、ASP水平显著较高(P<0.05)。与模型组相比，中、低、高剂量人参皂苷Rg1组GLU、NSE、ASP水平显著较低；
中、低剂量人参皂苷Rg1组与高剂量人参皂苷Rg1组相比，高剂量人参皂苷Rg1组GLU、NSE、ASP水平显著较低(P<0.05)；
中剂量人参皂苷Rg1组与低剂量人参皂苷Rg1组相比，中剂量人参皂苷Rg1组GLU、NSE、ASP水平显著较高(P<0.05)。
2.3各组脑组织病理学观察 如图1所示，空白组脑功能正常，脑组织结构完整，神经元胞体丰满，毛细血管无扩张充血，无明显病理改变；
模型组脑组织神经元出现明显形态结构病理性改变，包括神经元数量减少，胞质固缩、空泡变性，胞质着色不均、胞核深染等；
低剂量人参皂苷Rg1组大鼠大部分神经元失去正常结构，变性神经元有所减少；
中剂量人参皂苷Rg1组小部分神经元失去正常结构，变性神经元明显减少；
高剂量人参皂苷Rg1组正常神经元增多，变性神经元极少。
图1 各组脑组织病理观察(HE染色，×200)
2.4人参皂苷Rg1对大鼠Sema4D/Plexin B1信号通路蛋白相对表达量的影响 如表1、图2所示，与空白组相比，模型组、中、低、高剂量人参皂苷Rg1组Sema4D、Plexin-B1显著较高(P<0.05)；
与模型组相比，中、低、高剂量人参皂苷Rg1组Sema4D、Plexin-B1显著较低(P<0.05)；
与高剂量人参皂苷Rg1组相比，中、低剂量人参皂苷Rg1组Sema4D、Plexin-B1显著较高(P<0.05)；
与中剂量人参皂苷Rg1组相比，低剂量人参皂苷Rg1组Sema4D、Plexin-B1显著较高(P<0.05)。
表1 人参皂苷Rg1对大鼠脑梗死面积、神经功能评分、脑组织Glu、NSE、Asp含量及Sema4D/Plexin B1信号通路相关蛋白的影响
1～5：模型组，低剂量人参皂苷Rg1组，中剂量人参皂苷Rg1组，高剂量人参皂苷Rg1组，空白组图2 各组Sema4D、Plexin-B1表达比较
人参历史悠久，被视为是紧急关头的救命良药〔7〕。人参皂苷Rg1对于脑缺血损伤存在一定的治疗效果，该药不良反应及毒性较小，且方便提取，显著优于传统治疗方式〔8〕。另有研究显示，人参皂苷Rg1对神经再生、神经轴突可塑性具有一定的促进作用〔9〕。
脑组织易于产生活性氧，可氧化活性氮和不饱和脂肪酸，神经系统对自由基的抗性较弱，对于脑内环境的变化较为敏感〔12〕。对大鼠应用人参皂苷Rg1，可减少缺血再灌注带来的神经功能损伤、消除脑组织水肿，提升神经功能评分〔13〕。人参皂苷Rg1具有神经保护作用，可能通过改善一系列蛋白反应而抑制细胞凋亡的发生，从而发挥保护脑神经的作用〔14〕。而人参皂苷Rg1调控Sema4D/Plexin B1信号通路可显著改善血脑屏障的通透性。本文结果发现，人参皂苷Rg1。可改善大鼠神经功能评分，减小梗死面积，且高剂量人参皂苷Rg1效果优于中剂量、低剂量。
GLU为中枢神经系统重要的兴奋性神经递质，病理状态下，过度激活GLU具有较强的神经兴奋性毒性，脑细胞外液异常升高GLU，可诱导钙超载，激活自由基及信号通路，诱导细胞坏死，从而导致神经细胞的损害〔15〕。NSE是神经元损伤的标志物，存在于脑神经细胞及神经内分泌细胞中，其水平异常升高，提示神经元细胞受损，表示神经损害较为严重及梗死面积较大，脑梗死时，神经元坏死，破坏细胞膜的完整性〔16〕。GLU大量堆积，过度激活蛋白，并介导受体门控性离子通道开放，使离子、水进入细胞内，导致急性神经元肿胀、坏死，并引起细胞内离子超载〔17〕。本文结果说明，人参皂苷Rg1可使神经细胞和胶质细胞的损伤减小，脑损伤的程度减轻。
Semaphorins家族被报道在多种生理过程中发挥作用，Sema4D已被证实在血管及免疫系统中有着重要地位，作为一种免疫性脑信号蛋白，其免疫信号素可影响机体多种免疫功能及炎性因子的表达，通过敲除PlexinB1及阻断Sema4D信号作用，降低神经炎症反应〔18，19〕。Sema4D与PlexinB1受体进行信号转导，从而调控血脑屏障通透性〔20〕。人参皂苷Rg1具有促进脑梗死后脑组织血管新生的作用，抑制Sema4D/PlexinB1通路可缩小梗死体积，破坏血脑屏障通透性和内皮紧密连接蛋白〔21〕。本研究显示，经人参皂苷Rg1干预后，大鼠Sema4D、Plexin-B1表达较低，说明人参皂苷Rg1可能通过介导Sema4D/Plexin-B1信号通路缩小梗死体积。
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