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白玛泽仁，秦泸康，罗思富，肖晨冬
(四川省甘孜藏族自治州得荣县农牧局，四川 得荣 627950)
近年来，犊牛腹泻的发病率呈上升趋势，给养牛业造成了巨大经济损失[1]。犊牛腹泻是犊牛常发的一种胃肠疾病，其临床特征为：病犊牛常出现精神萎靡、食欲不振甚至废绝、体温上升、呼吸短促、脱水及腹泻等症状。临床上引发犊牛腹泻的病因复杂多样，包括非感染性和感染性的因素。非感染性主要有饲喂不当、护理不当或饲养环境恶劣等饲养管理方面的因素；
感染性主要有寄生虫、细菌和病毒等的感染因素。病毒性感染是造成犊牛腹泻最主要的病因之一，牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是临床上最常见的导致犊牛腹泻的病毒[2]；
产肠毒素大肠杆菌(ETEC)、沙门氏菌(Salmonella)和安氏隐孢子虫(C.andersoni)是常见的导致犊牛腹泻的细菌病和寄生虫病[3]，它们的流行病学、临床症状和病理变化均很相似，仅凭临床诊断无法鉴别，而且这几种病毒混合感染的情况也很常见[4]，需要进行实验室检测才能确诊[5]。
2021年11月甘孜藏族自治州理塘县某牧民家发生了犊牦牛腹泻病情，采用PCR方法对采集的11份犊牦牛腹泻样本进行了BRV、BCoV、BVDV、ETEC、Salmonella和C.andersoni检测，来查明引起该病的病因，结果报告如下。
1.1 样本采集
腹泻粪便棉拭子11份，2021年11月份采自理塘县某牧民家1～3月龄的犊牦牛，低温运输至实验室于-80℃冰箱保存。该牧民家共有犊牦牛28头，患病犊牦牛11头，主要出现精神萎靡、呼吸急促、体温升高、食欲废绝和腹泻等症状，粪便呈灰绿色水样。
1.2 主要试剂及仪器
TrizolTMReagent、Premix taq、PrimescriptTM反转录试剂盒、核酸染料-GelView等均购于宝生物工程(大连)有限公司；
凝胶成像系统(VersaDov2000)、电泳仪(JY300C/ERS300)、恒温水浴锅(DZKW-D-2)购于上海科升仪器有限公司(中国上海)；
高速冷冻离心机(TGL-16)购于蜀科仪器有限公司(中国四川)；
PCR仪(TC-96/G/H〔b〕c)购于博日科技有限公司(中国杭州)。
1.3 参考毒株
牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒、安氏隐孢子虫、沙门氏菌、产肠毒素大肠杆菌的阳性样本均为西南民族大学动物医学实验室保存。
1.4 引物的设计与合成
参照相关文献中有关BRV、BCoV、BVDV、ETEC、Salmonella和C.andersoni的检测方法合成引物，表1中为引物信息，所有引物的合成均由生工生物工程有限公司完成。
1.5 样本处理及核酸提取
将 11 份腹泻粪便棉拭子与适量的PBS涡旋混匀，反复冻融 3 次，置于 4℃离心机中10 000 r/min离心10 min，取上清，按照 Trizol 试剂盒(RNAiso Plus)说明书进行 RNA提取，将其保存于-80℃备用。采用10 μl体系：5×buffer 4μL，Random primer 2μL，Prime Script RNase 1μl，ddH2O 9μl，RNA 4μl；
反转录条件为：37 ℃，15 min；
85℃，15 s；
16℃，1 min，合成cDNA于-20℃保存备用。
1.6 PCR检测BRV
采用1.5合成的3对引物对11份犊牦牛腹泻样本的cDNA模板进行PCR扩增，均采用25μL的反应体系如下：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.5 μL，cDNA 2.0μL，ddH2O 7.5 μL。PCR扩增条件为:94℃，5 min；
94℃，30 s；
53℃，30 s；
72℃，30 s；
72℃，5 min。取扩增产物经2%琼脂糖凝胶核酸电泳后，用凝胶成像系统成像。将阳性PCR产物送至生物工程(上海)股份有限公司测序。
2.1 被检样本的RT-PCR检测结果
电泳结果显示：通过实验对11份犊牦牛腹泻粪便棉拭子样本中BRV、BCoV、BVDV、ETEC、Salmonella和C.andersoni的PCR检测，结果见图 1。图1中有8份样本扩增得到BRV 特异性条带，片段大小约为 231 bp，其他引物均未检出。
注：M—DL2000 Marker;N—阴性对照；
P—阳性对照；
1～11—被检样本BRV扩增产物。
2.2 阳性检出率及感染情况
通过RT-PCR方法检测，发病犊牦牛11份腹泻样本里，牛轮状病毒的阳性检出率是72.7%(8/11)，BCoV、BVDV、ETEC、Salmonella和C.andersoni均未检出。结合临床症状及流行情况，确诊该牧民家犊牦牛腹泻主要由牛轮状病毒(BRV)感染引起的。
试验检测结果中的犊牦牛腹泻样本只检出了BRV，检出率高达72.7%，BCoV、BVDV、ETEC、Salmonella和C.andersoni均未检出，再与临床症状进行结合分析后，可确诊该牧民家犊牦牛出现腹泻主要是由BRV导致的，为该牧民家牦牛腹泻的防治提供了科学依据。
研究显示，牛轮状病毒在我国十分流行，何美琳等[6]为调查川西北牦牛腹泻病的流行情况，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对来源于川西北阿坝藏族羌族自治州8个县的1 070份牦牛血清中进行了BVDV、BCoV、BRV的抗体检测，其中BRV抗体阳性率达到94.4%；
周芳等[7]对四川阿坝藏族羌族自治州14个牧场的88份犊牦牛腹泻样本用特异的PCR方法进行了BRV的检测，结果显示BRV核酸阳性检出率为98.86%；
李凡等[8]用PCR方法对30份牛腹泻样本和30份牦牛腹泻样本进行BRV的检测，其中对牛的BRV检出率为33.33%，对牦牛的BRV检出率为73.33%；
何宗伟等[9]对稻城县牦牛主要养殖区域的5个乡镇采集了46份牦牛粪便样本，用RT-PCR方法进行病原检测。结果显示46份粪便样本中BRV检出的阳性样本数为16份，BRV的阳性检出率为34.78%，表明稻城县牦牛BRV感染情况较为普遍。
BRV是引起犊牛腹泻的最重要的病原，可感染各个年龄段的牛，且多发于1月龄以内的犊牛，在全世界尤其是发展中国家犊牛中存在严重的发病率及死亡率，给牧民养牛业和畜牧业发展造成了巨大的经济损失。此外，BRV常常成为诱发、并发或继发其他一些腹泻性疾病的病因，在临床上出现混合感染情况很严重[10]，对人类健康和畜牧业发展都有较大危害，具有重要的公共卫生学意义[11]。因此，加强牛轮状病毒病的防治至关重要。
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