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顾晓风，李玥琦，田沛霖
（江苏省苏州市药品检验检测研究中心，江苏 苏州 215104）
甲钴胺是维生素B12在体内的活性形式之一，可通过刺激神经细胞合成卵磷脂改善神经传导速度，修复损伤后的髓鞘［1］。其制剂甲钴胺注射液，临床用于治疗周围神经病及因缺乏维生素B12引起的巨红细胞性贫血，对2 型糖尿病（T2DM）引起的神经病变疗效也较好［2-3］。注射用辅料具有赋形、提高稳定性、增溶助溶等重要功能，是影响药品质量、安全性和有效性的重要成分［4］。甲钴胺注射液中除注射用水外，还添加了甘露醇作为药用辅料。甘露醇在注射剂中主要起填充剂［5］的作用，对药物的稳定性有一定影响［6-7］。2020年5月，国家药品监督管理局正式启动化学仿制药注射剂一致性评价［8］。建立准确有效的方法、研究注射剂辅料的种类和用量，对于保障产品的质量及完成一致性评价均有一定意义。电喷雾检测器（CAD）是近年来兴起的通用型检测器，其对化合物的结构无特定要求，可检测不挥发或半挥发性物质，特别适用于弱紫外吸收或无紫外吸收成分的分析，灵敏度高、稳定性和重复性好，结合高效液相色谱（HPLC）法已广泛用于药物分析领域［9-12］。本研究中建立了测定甲钴胺注射液中甘露醇含量的HPLC -CAD 法，旨在为完善该制剂质量标准、保障其产品质量提供参考。现报道如下。
1.1 仪器
UltiMate 3000型高效液相色谱仪，配有Corona Veo RS电雾式检测器，变色龙工作站（美国Thermo Fisher公司）；
XS205DU 型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，精度为0.01 mg）；
Millipore Synergy 超纯水机（密理博＜中国＞有限公司）。
1.2 试药
甲钴胺注射液（A 公司，批号分别为200611A，200204A，190405A）。甘露醇对照品（批号100533 -202006，含量为99.5%）、甲钴胺对照品（批号100692 -201805，含量为92.8%），均购自中国食品药品检定研究院；
乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为去离子水。
2.1 色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB -C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），流动相：15%乙腈（A）-80%乙腈（B），梯度洗脱（洗脱程序见表1）；
流速：0.5 mL/min；
柱温：30 ℃；
进样量：20 μL。检测器：CAD；
雾化气体：氮气；
蒸发管温度：35 ℃；
增益值：1；
幂函数：1.0；
采集频率：10 Hz；
过滤常数：3.6。
表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution program
2.2 溶液制备
对照品溶液：取甘露醇对照品约100 mg，精密称定，置100 mL 容量瓶中，用流动相A 溶解并定容，摇匀，制成质量浓度为1.0 mg/mL的对照品溶液。
供试品溶液：精密量取甲钴胺注射液1 mL，置100 mL容量瓶中，用流动相A定容，摇匀，作为供试品溶液。
空白对照溶液：取甲钴胺对照品约10 mg，精密称定，置20 mL 容量瓶中，用流动相A 溶解并定容，摇匀；
精密移取1 mL，置100 mL 容量瓶中，用流动相A 定容，作为空白对照溶液。
2.3 方法学考察
系统适用性试验：取空白对照溶液、对照品溶液（甘露醇质量浓度为0.5 mg/ mL）和供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果目标物峰理论板数大于10 000，拖尾因子小于1.2，且空白对照无干扰，详见图1。
图1 高效液相色谱图1.Mannitol 2.MecobalaminB.Reference solution B.Test solution C.Blank control solutionFig.1 HPLC chromatograms
线性关系考察：分别精密量取甘露醇对照品溶液1，2，3，5，8 mL，置10 mL 容量瓶中，用流动相A 稀释至刻度，摇匀，得系列对照品溶液。取10 μL 进样测定，记录峰面积，以对照品系列溶液的质量浓度（mg/mL）对数值（X）为横坐标，以峰面积对数值（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=0.718 8X+1.120 1（r=0.999 2）。结果表明，甘露醇质量浓度在0.105～1.05 mg/ mL 范围内其对数值与峰面积对数值线性关系良好。
定量限与检测限考察：精密量取质量浓度为0.5 mg/ mL 的对照品溶液，逐级稀释并进样测定。取信噪比（S/N）约为10∶1，3∶1 时的待测成分质量浓度作为定量限和检测限，结果分别为0.70 μg/ mL 和0.21 μg/mL。
精密度试验：取2.2 项下对照品溶液（质量浓度为0.5 mg/mL），按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果甘露醇峰面积的RSD为1.03%（n=6），表明仪器精密度良好。
稳定性试验：取供试品溶液（批号为200611A）适量，按2.1 项下色谱条件，分别于0，4，8，12，16，24 h 进样测定，记录峰面积。结果甘露醇峰面积的RSD为1.21%（n=6），表明供试品溶液在室温放置24 h内基本稳定。
重复性试验：取样品（批号为200611A）适量，按2.2 项下方法平行制备6 份供试品溶液，再按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果甘露醇峰面积的RSD为1.32%（n=6），表明方法重复性良好。
加样回收试验：精密移取样品（批号为200611A）1 mL，置200 mL 容量瓶中，平行制备9 份，分成3 组，每组3份。每组分别加入甘露醇对照品70，50，30 mg，用流动相A 溶解并定容，摇匀，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果见表2。
表2 加样回收试验结果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）
2.4 样品含量测定
取3 批样品适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以标准曲线法计算含量。结果批号为200611A，200204A，190405A 的样品中甘露醇含量分别为50.71，50.62，50.21 mg/mL。
3.1 检测器选择及优化
甘露醇的含量测定多采用高效液相色谱-示差折光检测器（HPLC -RID）法［6］、高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC -ELSD）法［7］、离子色谱法［13］等。RID检测器对压力和温湿度的变化敏感，灵敏度低，且不能兼容梯度洗脱；
ELSD检测器灵敏度比RID检测器高，对温度变化不敏感，可用于梯度洗脱，但重现性较差；
而离子色谱仪器昂贵，普及性不如液相色谱，且其中使用的氢氧化钠（钾）可能导致糖类异构化和分解［14-15］。CAD检测器对化合物的结构无特定要求，适用于梯度洗脱，灵敏度、稳定性和重现性均具有明显优势［16］。
过滤常数分别考察了1.0，3.6，5.0，10.0，当设为1.0 时，甘露醇峰分叉，设为10.0 时，峰形明显展宽，理论板数下降，故选择3.6；
采集频率考察了5，10，25 Hz，色谱峰均无明显差异；
试验中发现，幂函数增大，峰面积明显下降，但对检测结果的影响在2%范围内，考虑过高的幂函数可能会在接近动态范围下限的响应中产生或夸大“衰减”［14］，最终幂函数设为1.0；
蒸发管温度考察了35 ℃和50 ℃，当温度为50 ℃时，峰面积下降10%，灵敏度较35 ℃差，故选择35 ℃。
3.2 色谱条件优化
色谱柱：甘露醇测定常用的色谱柱有强阳离子钙型交换柱、氨基柱、C18柱等，甲钴胺则常用C18柱、氨基柱和氰基柱。强阳离子钙型交换柱使用时柱温要求较高（70～80 ℃），价格昂贵且耐用性差；
氨基柱的耐用性亦较C18柱差，填料易塌陷，使用过程中柱压逐渐升高，对甘露醇及甲钴胺的吸附均大于C18柱，分析时间长。本试验中选择常规C18色谱柱进行分析。考察了Agilent ZORBAX SB -C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、Phenomenex Luna C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）和Waters Symmetry C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），结果色谱峰形均较好。
流动相：考察流动相中乙腈不同比例对分离的影响，随着乙腈比例升高，甘露醇峰形展宽，在80%乙腈条件下，甘露醇峰出现肩峰，故选择乙腈比例较低的流动相；
而低比例有机相对甲钴胺洗脱能力差，在15%乙腈条件下，甲钴胺保留时间超过40 min，故最终确定梯度洗脱，以保证甘露醇峰形良好并缩短分析时间。
流速与柱温：当流速为1.0 mL/ min 时，甘露醇保留时间过短，受溶剂峰干扰，故选择0.5 mL/min；
不同柱温（30，35，40 ℃）对分离及峰形无明显影响。
3.3 线性回归方式选择
本研究中目标物进样质量浓度约为0.5 mg/ mL，在0.1～1.0 mg/mL 范围内，以甘露醇质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归时，得相关系数为0.994，而分别取对数后进行回归，相关系数为0.999 2。参考2020 年版《中国药典（四部）》，确定经对数转换后进行回归。
3.4 方法评价
本研究中建立了测定甲钴胺注射液中甘露醇含量的HPLC-CAD法，该方法简单灵敏，准确度高，耐用性好，可用于甲钴胺注射液的质量控制。甘露醇为重要药用辅料，除传统化学药外，也广泛用于生物大分子药物，本研究中所建立的方法也可为其中甘露醇含量测定提供参考。
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