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姬姝婷,曹青,聂蒙,董雨豪,刘广锦,刘永杰
(南京农业大学动物医学院,江苏 南京 210095)
无乳链球菌(Streptococcusagalactice)又称B群链球菌(Group BStreptococcus,GBS),是一种革兰阳性球菌,最早因引起奶牛乳房炎而得名。随后发现该菌是新生儿脑膜炎、肺炎、败血症的重要病原,因而受到进一步关注[1-2]。2009年以来,我国南方多个省市的罗非鱼养殖场大规模暴发链球菌病,由于感染鱼死亡率极高,造成了严重的经济损失,甚至给罗非鱼的养殖生产造成了毁灭性打击。该病主要病原为无乳链球菌,其最突出的致病特点是引发脑膜炎[3-5]。研究表明,无乳链球菌的致病性与其产生的大量毒力因子有关,包括黏附侵袭相关因子如纤维蛋白原结合蛋白(Fbs)、层黏连蛋白结合蛋白(Lmb)、表面锚定蛋白、侵袭相关蛋白(IagA)、菌毛,胞外毒素如β溶血素(β-H/C)等[6]。尽管大量的毒力因子被发现,该菌的致病机制尚未阐明。
温和噬菌体又称溶原性噬菌体,它可将自身基因组作为宿主染色体的一部分整合于宿主菌基因组中,即前噬菌体(prophage)。前噬菌体与宿主建立较稳定的寄生关系,是细菌之间进行基因水平转移的重要载体之一[7]。越来越多的研究表明,前噬菌体可通过多种方式对其宿主产生影响,其诱导的基因整合事件能帮助宿主菌得到对自身进化有益的DNA 序列,影响其毒力及抗应激能力,并参与霍乱弧菌、铜绿假单胞菌等宿主菌的生物被膜形成[8-9]。对单增李斯特菌的研究证实,前噬菌体还可通过激活逃避吞噬小体相关基因comK的表达,从而协助细菌在巨噬细胞内存活[10]。研究发现,70%以上无乳链球菌分离株的基因组中至少包含1个前噬菌体,且其基因簇上大多携带与毒力或宿主适应性有关的基因[11]。Liu等[12]利用在线软件PHASTER分析无乳链球菌GD201008-001基因组中可能存在的前噬菌体序列,结果发现该基因组中仅有1个前噬菌体并命名为lamdaSa04,该前噬菌体结构完整,两端包含AttL/AttR整合位点,但其功能尚不清楚。本研究以前噬菌体lamdaSa04为研究对象,利用基因敲除技术并结合生物学特性分析,探讨其对无乳链球菌环境适应性以及致病性的影响,为进一步解析该菌致病机制提供理论依据。
1.1 菌株及质粒
无乳链球菌GD201008-001为本课题组于2010年在广州肇庆暴发链球菌病的罗非鱼体内分离[13]。大肠杆菌DH5α购自北京擎科新业生物技术有限公司;热敏自杀性质粒pSET-4s[14]由日本学者Daisuke Takamatsu馈赠。
1.2 细胞与动物
小鼠巨噬细胞RAW264.7及人喉癌上皮细胞HEp-2,购自美国模式培养物集存库(ATCC);ICR小鼠购自扬州大学实验动物中心。
1.3 主要试剂和仪器
主要试剂:TaqDNA聚合酶、同源重组连接酶、2×PCR PreMix、DNA Marker(Vazyme),限制性核酸内切酶、DnaseⅠ、SYBR Premix ExTaqKit(TaKaRa),DNA片段提取、质粒提取、反转录和细菌总RNA提取试剂盒(OMEGA),壮观霉素(Spc),DMEM培养基(Gibco),热灭活的胎牛血清、96孔细胞板(Corning)等。
主要仪器:PCR仪(Bio-Rad/Biometra),核酸电泳仪(南京科宝仪器研究所),凝胶自动成像系统(ChemiDoc MP,Bio-Rad),酶标仪(MultiskanGO,Thermo Scientific),Gene Pulse X CellTM型电穿孔仪(Bio-Rad)等。
1.4 前噬菌体lamdaSa04的基因序列编码区(CDS)结构分析
运用前噬菌体分析软件PHASTER(http://phaster.ca/)对无乳链球菌中编码的前噬菌体lamdaSa04的基因编码区(CDS)结构进行分析。
1.5 前噬菌体lamdaSa04缺失株的构建及鉴定
采用无乳链球菌GD201008-001作为野生株(WT),据其基因组序列(GenBank:CP003810.1)设计引物(表1)。使用引物对Sa04-P1/P2扩增上游同源臂,用引物对Sa04-P3/P4扩增下游同源臂。通过融合PCR,以上下游同源臂PCR扩增回收片段为模板,使用引物Sa04-P1/P4扩增,融合上下游同源臂并将其连接至温敏性自杀质粒pSET-4s。将质粒电转化入无乳链球菌GD201008-001感受态细胞进行同源重组。根据Takamatsu等[14]的方法,通过抗性平板和PCR鉴定筛选出单交换后的lamdaSa04基因缺失株。
表1 引物信息Table 1 Primer information
lamdaSa04基因缺失株(ΔlamdaSa04)构建引物均由苏州金唯智(GENEWIZ)生物技术有限公司合成。
1.6 菌株生长情况检测
1.6.1 生长曲线测定分别取菌株WT、ΔlamdaSa04过夜培养的新鲜菌液1 mL,接种至100 mL THB液体培养基,并置于37 ℃、180 r·min-1振荡培养,每2 h检测菌液D600,并以此绘制生长曲线。
1.6.2 生物被膜形成试验采用改良的定量微孔板法,试验前需先制备菌悬液。在37 ℃、180 r·min-1条件下用THB培养基接种新鲜培养菌液,12 h后取菌液,按1∶100的体积比转接于新鲜THB培养基中进行再培养,3 h左右培养至对数期,用THB培养基调节D600至1.0,再用新鲜THB液体培养基将菌液稀释 1 000倍,待用。
在96孔细胞板中每孔加入200 μL WT及ΔlamdaSa04菌悬液,每列8孔,37 ℃孵育24 h,以仅加入无菌THB液体培养基的孔作为阴性对照。将上层培养物及杂质抽离后,用无菌PBS清洗3次,除去浮游菌体后用甲醇固定。室温风干后再加入200 μL结晶紫静置染色10 min,无菌PBS清洗3次。待完全干燥后每孔加入200 μL 90%乙醇溶液,轻微摇晃10 min溶解结晶紫,随后用酶标仪测定其D595值,重复3次取均值评价菌株生物被膜形成能力。
1.7 菌株抗高渗透压及氧化应激能力检测
1.7.1 高渗应激WT、ΔlamdaSa04均在新鲜THB培养基中培养过夜,收集菌泥沉淀弃上清液,用含终浓度为0.2 mol·L-1氯化钠(NaCl)的培养基重悬调整D600为0.2。细菌悬液于37 ℃ 孵育8 h,每间隔1 h测量1次D600值,绘制生长曲线并比较2株菌生长繁殖速度。试验重复3次,每次设置3个样品重复。
1.7.2 氧化应激WT、ΔlamdaSa04在THB培养基中培养到对数生长期并调整D600为0.6,2个菌株各设 3种培养环境,分别为含10和20 mmol·L-1过氧化氢(H2O2)的THB培养基试验组,以不添加 H2O2的培养基作为对照组。菌株均于37 ℃孵育20 min,反应液经10倍梯度稀释数次后选择合适稀释度涂平板计数。试验重复3次,每次设置3个样品重复。
1.8 菌株抗巨噬细胞吞噬与胞内存活试验
分别设置0、2、4、6、8和12 h共6个试验时间点并分别对应1个24孔细胞培养板,将小鼠巨噬细胞RAW264.7铺入细胞板待形成单层细胞用于后续试验。加入新鲜培养基培养至对数期的WT、ΔlamdaSa04用无菌PBS洗3次,用DMEM调整菌液浓度以感染比(MOI)为1.0接种细胞,每个菌株每板接种8孔,剩余菌液倍比稀释后平板计数。将细胞板于室温下800g离心10 min,放入细胞培养箱培养1 h。弃去上层菌液后用PBS轻轻洗涤单层细胞5次,然后加入1 mL含终质量浓度100 μg·mL-1青霉素G的DMEM培养液,继续培养1 h杀死胞外细菌(此时计为吞噬试验0 h),用无菌水裂解细胞并以平板计数法来计算胞内菌量。然后分别在2、4、6、8和12 h裂解细胞,计算胞内存活菌量。吞噬率和细菌各时间点的存活率按照如下公式计算:
1.9 模拟巨噬细胞内环境的多重应激条件下菌株存活能力检测
模拟细菌在吞噬细胞中可能遇到的不同应激环境,进行一系列应激试验。参考Korir等[15]的试验,生存条件设置如下:1)5 mmol·L-1H2O2的环境;2)pH4.5 PBS条件下加入10 mmol·L-1亚硝酸钠(NaNO2),形成一氧化氮(NO)的环境;3)100 μg·mL-1溶菌酶(Lyz)的环境;4)pH4.5酸性环境;5)pH4.5条件下含 5 mmol·L-1H2O2的酸性过氧环境;6)在pH4.5条件下同时含有1.5 mmol·L-1H2O2、3 mmol·L-1NaNO2、100 μg·mL-1Lyz的多重应激环境。分别测试WT及ΔlamdaSa04在不同应激条件下的生长情况,以无菌PBS条件为对照。具体操作同1.7.2节氧化应激试验。
1.10 菌株黏附及侵袭上皮细胞能力检测
将人喉癌上皮细胞HEp-2接种于24孔无菌细胞培养板中,待长成细胞单层后,用PBS洗涤3次,加入无抗性DMEM 培养液,再加入培养至对数期的WT、ΔlamdaSa04,用无菌PBS洗3次,用DMEM调整菌液浓度以MOI为1.0接种细胞,37 ℃作用2 h。吸弃培养液,用PBS洗涤3次。部分细胞用无菌双蒸水裂解,将细胞裂解液梯度稀释后涂布THB固体培养基,37 ℃培养过夜,用以计算细菌黏附率。另一部分未裂解细胞用PBS洗涤后,加入含终质量浓度100 μg·mL-1青霉素G的DMEM 培养液处理细胞,继续培养 1 h 后用无菌水裂解细胞,进行平板计数以计算侵袭率。试验重复3次,每次设3个样品重复。黏附率和侵袭率按照如下公式计算:
1.11 菌株感染小鼠的致死能力及组织细菌载量检测
1.11.1 致死率测定将WT及ΔlamdaSa04培养至对数期,离心收集菌体后用PBS洗3次,再重悬于PBS中调整浓度至1.0×103CFU·mL-1。将30只5周龄雌性ICR小鼠随机分为3组(空白对照、WT及ΔlamdaSa04组,每组10只),WT及ΔlamdaSa04组分别腹腔注射100 μL菌液,空白对照组注射等量PBS。每2 h观察一次并记录小鼠死亡情况。
1.11.2 组织细菌载量测定将WT及ΔlamdaSa04培养至对数期,离心收集菌体用无菌PBS洗3次后重悬于PBS中,将菌液浓度调整为1.0×103CFU·mL-1。将18只5周龄雌性ICR小鼠随机分为3组(空白对照、WT及ΔlamdaSa04组,每组6只),WT及ΔlamdaSa04组每只小鼠腹腔注射100 μL菌液,空白对照组注射等量PBS。16 h后采集小鼠血液、脑及脾脏,称取脏器质量后高速匀浆,组织匀浆液与血液分别倍比稀释后采用平板计数法检测各菌株在感染小鼠脑、脾及血液的载量。公式如下:
细菌载量=lg(各组织细菌数/各组织质量)。
1.12 统计学分析
试验数据采用Excel 2013软件计算平均值,采用Graphpad Prism7.0软件对野生株及缺失株的各检测参数进行方差分析和差异显著性分析(t检验)并绘图。
2.1 无乳链球菌前噬菌体lamdaSa04的CDS结构分析
采用前噬菌体分析软件PHASTER对无乳链球菌GD201008-001全基因组进行分析,发现lamdaSa04位于基因组第639 123～668 474位碱基,全长29.3 kb,共编码28个CDS,DNA(G+C)比例为43.32%;与lamdaSa04相似性最高的噬菌体为链球菌噬菌体PH10,相似性为43.12%。lamdaSa04 CDS结构如图1所示。
图1 前噬菌体lamdaSa04编码区(CDS)结构Fig.1 Genomic organization of coding sequences(CDS)of prophage lamdaSa04Att:附着位点;PLP:噬菌体样蛋白;Hyp:假定蛋白;Ter:末端酶;Por:门蛋白;Sha:尾轴;Coa:衣壳蛋白。Att:Attachment site;PLP:Phage-like protein;Hyp:Hypothetical protein;Ter:Terminase;Por:Portal protein;Sha:Tail shaft;Coa:Coat protein.
2.2 无乳链球菌前噬菌体lamdaSa04缺失株的鉴定
重组缺失质粒送至苏州金唯智生物科技公司测序后,通过NCBI的BLAST功能在线比对确认序列正确无误。利用同源重组技术构建lamdaSa04缺失株(图2-A),PCR鉴定结果如图2-B所示。以野生株为模板,同源臂引物Sa04-P1/P4扩增无条带,内部检测引物Sa04-T1/T2扩增片段大小为1 207 bp;以缺失株为模板,Sa04-P1/P4引物扩增片段大小为1 266 bp,Sa04-T1/T2引物扩增无条带,与预计结果相符,说明ΔlamdaSa04构建成功。
2.3 lamdaSa04缺失对细菌生长及生物被膜形成能力的影响
通过绘制生长曲线可知,在37 ℃条件下,WT与ΔlamdaSa04的生长速率无明显差异(图3-A),说明lamdaSa04并不影响无乳链球菌GD201008-001在THB培养基中的生长。另外,生物被膜检测试验结果显示,野生株D595值显著高于缺失株(P<0.000 1),表明前噬菌体lamdaSa04在鱼源无乳链球菌生物被膜形成过程中起重要作用(图3-B)。
图2 无乳链球菌前噬菌体lamdaSa04缺失株的构建(A)与PCR产物(B)的鉴定Fig.2 Construction(A)and PCR product identification(B)of lamdaSa04 gene mutant strain of S.agalactiaeLane 1. Primers Sa04-P1/P4,WT;Lane 2. Primers Sa04-T1/T2,WT;Lane 3. Primers Sa04-P1/P4,ΔlamdaSa04;Lane 4. Primers Sa04-T1/T2,ΔlamdaSa04.
图3 无乳链球菌生长曲线(A)及生物被膜形成能力(B)Fig.3 Growth curve(A)and biofilm formation abilities(B)of S.agalactiae strains****P<0.000 1,***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05. The same as follows.
2.4 lamdaSa04缺失对细菌抗应激能力的影响
2.4.1 抗高渗应激采用高渗透压条件(0.2 mol·L-1NaCl)培养野生株及缺失株,观察其生长情况。如图4-A 所示:在高浓度NaCl存在时野生株及缺失株生长均被抑制,在对数生长前期(3～6 h)WT的受抑制程度比ΔlamdaSa04略大,但差异不显著(P>0.05),表明前噬菌体lamdaSa04对于细菌抗高渗透压环境无明显作用。
2.4.2 抗氧化应激采用强氧化条件(10和20 mmol·L-1H2O2)37 ℃培养野生株及缺失株20 min,检测其生长存活能力。如图4-B所示:在2个浓度的H2O2作用下,ΔlamdaSa04的存活率均显著低于野生株(P<0.01),说明lamdaSa04有助于菌株抵抗外部的强氧化环境。
图4 无乳链球菌抗高渗透压(A)及抗氧化应激能力(B)Fig.4 Anti-hyperosmotic pressure(A)and anti-oxidative stress(B)abilities of S.agalactiae strains
2.5 lamdaSa04缺失对细菌抗吞噬与胞内存活能力的影响
如图5-A显示:在相同条件下,与WT菌株相比,ΔlamdaSa04被巨噬细胞吞噬率更高,且差异显著(P<0.01),说明无乳链球菌在缺失lamdaSa04后抗吞噬能力显著下降。胞内存活能力测定(图5-B)表明,ΔlamdaSa04在被巨噬细胞吞噬2及4 h的存活率均显著低于野生株(P<0.01)。由此推断,前噬菌体对于无乳链球菌的抗吞噬及其在吞噬细胞内前期的存活能力有显著影响。
图5 无乳链球菌的抗巨噬细胞吞噬(A)及胞内存活能力(B)Fig.5 Anti-macrophage phagocytosis(A)and intracellular survival ability(B) of S.agalactiae strains in macrophages
2.6 lamdaSa04缺失对多重应激条件下细菌存活的影响
为进一步研究前噬菌体影响细菌抗吞噬能力的因素,模拟了在巨噬细胞中可能遇到的条件,观察WT及ΔlamdaSa04的生长存活能力。如图6-A所示:在设置包含H2O2、NO、Lyz、强酸等多重胁迫因素的应激环境下,菌株生长受到不同程度影响,其中在H2O2、强酸组及pH4.5+H2O2组中ΔlamdaSa04存活率显著低于野生株(P<0.01)。如图6-B所示:在上述应激因素同时存在的条件下,ΔlamdaSa04存活率降低更加明显(P<0.001),说明lamdaSa04的存在有助于无乳链球菌抵抗巨噬细胞内的酸性及氧化胁迫环境。
图6 lamdaSa04缺失对多重应激条件下无乳链球菌存活的影响Fig.6 Effect of lamdaSa04 deletion on the survival of S.agalactiae under multiple stressA. 5种不同应激因素Five different stressors;B. 多种应激因素联合Combination of multiple stress factors.
2.7 lamdaSa04缺失对细菌黏附及侵袭上皮细胞能力的影响
在菌株与HEp-2细胞作用2 h后,检测WT与ΔlamdaSa04对细胞的黏附侵袭能力。结果(图7)显示:与WT相比,ΔlamdaSa04的黏附及侵袭能力均有明显增强(P<0.05)。
图7 lamdaSa04缺失对无乳链球菌黏附(A)及侵袭(B)能力的影响Fig.7 Effect of lamdaSa04 deletion on adhesion rate(A)and invasion rate(B)of S.agalactiae strains
图8 lamdaSa04缺失对无乳链球菌感染小鼠存活率的影响Fig.8 Effect of lamdaSa04 deletion on survival rates of mice infected with S.agalactiae strains
2.8 lamdaSa04缺失对细菌致病性的影响
2.8.1 对致死率的影响以ICR小鼠为模型检测了菌株的致死率。WT感染小鼠在18 h时开始出现2只小鼠死亡,20 h时累计死亡8只,22 h后全部死亡;而ΔlamdaSa04感染的小鼠同样在18 h时出现首例死亡,20 h时死亡9只,26 h时全部死亡(图8)。表明lamdaSa04的缺失对小鼠致死率并无显著影响。
2.8.2 对组织细菌载量的影响无乳链球菌感染小鼠16 h后的组织载量结果(图9)显示,不论是在血液、脑组织还是脾脏组织中,ΔlamdaSa04的细菌载量与野生株相比均无显著差异(P>0.05)。
图9 lamdaSa04缺失对无乳链球菌感染小鼠组织脏器细菌载量的影响Fig.9 Effect of lamdaSa04 deletion on bacterial burden in the tissues from mice infected with S.agalactiae strains
前噬菌体是细菌间基因水平转移的重要载体,通过插入细菌基因组可为细菌带来新的表型或生物学特性的改变[16]。自从β-棒状杆菌前噬菌体在白喉杆菌中被发现与该菌毒力密切相关以来,大量的前噬菌体功能逐渐为人们所认识。在已有研究中,比较经典的例子是λ噬菌体bor和lom的插入分别增强了宿主菌对血清的抵抗能力和在巨噬细胞内的存活能力[17]。Rabinovich等[10]报道,单增李斯特菌在巨噬细胞内通过切离前噬菌体,表达功能性蛋白ComK,使Com系统功能恢复,从而逃避吞噬小体的杀伤;Li等[18]研究发现,禽致病性大肠杆菌前噬菌体Phiv142-3增强了该菌的定殖能力及其对环境应激的抵抗力。目前,关于无乳链球菌前噬菌体的生物学功能尚未见报道。本文针对鱼源无乳链球菌GD201008-001中的唯一前噬菌体lamdaSa04生物学特性开展研究,证实lamdaSa04对增强无乳链球菌的环境适应性发挥重要作用。
细菌在生长及感染过程中首先要应对复杂的环境,如水产病原菌在水体及鱼体内中可能会遇到高渗透压环境、紫外辐射、胞外氧化物等外环境的刺激,因此抵抗应激环境的能力对于细菌的存活及在宿主体内进一步增殖扩散有重要作用[19]。本研究通过对无乳链球菌在高渗透压环境、强氧化环境的生存能力进行检测,发现前噬菌体lamdaSa04的存在可以提高宿主菌在氧化应激环境下的生存能力,而这种抗应激能力曾被报道与该菌在罗非鱼胃肠道上皮细胞的定殖及突破血脑屏障有紧密联系[20-21]。另有研究证实,无乳链球菌可在人或鱼类的肠道及大脑内形成生物被膜并进入一种滞留菌的状态,能够无视宿主的防御、抵抗抗生素治疗,从而实现对宿主的慢性感染,故生物被膜形成是无乳链球菌引发鱼类脑膜脑炎的关键因素[5]。本研究结果显示,lamdaSa04有助于宿主菌形成生物被膜,再次证明了前噬菌体与宿主菌环境适应性有着紧密联系。序列分析显示,lamdaSa04的基因簇中包含一些已被证实能够调控细菌适应环境条件的关键基因,例如clpP能帮助猪链球菌抵抗氧化应激及酸应激条件[22],Ⅱ型毒素-抗毒素系统显著影响铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌[23-24]的生物被膜形成等,那么lamdaSa04在无乳链球菌适应环境能力上的作用是否与这些基因有关,值得深入研究。从本试验中还发现,lamdaSa04可显著提高宿主菌对巨噬细胞吞噬的抵抗能力,并在一定程度上有助于菌株在巨噬细胞内前期的存活,这提示菌株胞内存活能力涉及的因素十分复杂,而前噬菌体可能仅在菌株被吞噬的初期阶段发挥作用。通常情况下细菌在巨噬细胞吞噬小体内会面临强酸、活性氧(ROS)、活性氮(RNS)、溶菌酶等胁迫因素[25]。为进一步探索前噬菌体影响无乳链球菌在巨噬细胞内存活的机制,本研究参考Korir等[15]的报道,对于该菌可能遇到的胞内环境进行模拟,设置多因素组合的应激条件并检测菌株存活率,结果证实前噬菌体的存在有助于无乳链球菌应对巨噬细胞内的酸性及强氧化应激因素,从而提高存活能力。
值得注意的是,在本研究中,lamdaSa04缺失株的黏附侵袭能力较野生株略强,这与在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的ΦSPβ样前噬菌体[26]、禽致病性大肠杆菌前噬菌体Phiv142-3[18]的研究结果相反,推测可能在lamdaSa04的基因簇中存在某些与黏附侵袭作用相关的负调控基因。有研究发现,脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitidis)在感染细胞表面通过前噬菌体切离会产生噬菌体丝状束,促进细菌聚集,从而增加细菌在上皮细胞上的定殖[27]。关于lamdaSa04如何调控无乳链球菌的黏附侵袭,有待进一步研究。
越来越多的研究表明,前噬菌体和细菌毒力密切相关。多数情况下,前噬菌体基因簇上携带有毒力基因并整合至宿主菌,从而增强宿主菌的毒力。例如,金黄色葡萄球菌PS42-D产生的与该菌致病有关的肠毒素A,其基因存在于前噬菌体上[28];非致病性的霍乱弧菌由于整合了编码霍乱毒素的前噬菌体CTXφ而转变为致病性的霍乱弧菌[29]。也有少数研究表明,前噬菌体可降低细菌毒力,如Chen等[30]报道支气管败血波氏杆菌前噬菌体PHB09插入到菌毛蛋白基因中,破坏了菌毛蛋白的合成,从而导致菌株毒力下降。然而,本研究发现lamdaSa04敲除后并未影响无乳链球菌对小鼠的致病性,这一点似乎与该基因簇参与生物被膜形成、抗巨噬细胞吞噬消化等毒力相关特性的结果不符。实际上也不难解释,病原对宿主的致病性与多种因素有关,不仅取决于病原本身的致病性,还与宿主的免疫应答有关。无乳链球菌lamdaSa04缺失后对宿主先天免疫的影响尚不清楚,值得后续研究。
综上所述,本研究发现前噬菌体lamdaSa04基因簇的缺失对宿主菌的致病性未表现出显著影响,但有助于宿主菌的环境适应性,既可提高对某些特定应激因素的抗性,又可通过提高生物被膜形成能力等方式促进宿主菌的生存。研究结果为无乳链球菌感染致病机制的研究及防控策略的制定提供了新的思路。
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