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侯 敏，谢玉为，毛怡心，张 晓，张 良，王园媛，郑和辉，顾 雯，雒月云，周海健，姚孝元，张 岚，唐 宋,4*
1.中国疾病预防控制中心环境与人群健康重点实验室，中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所，北京 100021
2.萨斯喀彻温大学毒理学中心，萨斯喀彻温萨斯卡通SK S7N5B3
3.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，传染病预防控制国家重点实验室，北京 102206
4.南京医科大学公共卫生学院全球健康中心，江苏南京 211166
新冠肺炎(COVID-19)是近百年来人类遭遇的影响最大、波及范围最广的全球性重大传染病.截至2022年6月27日，全球累计确诊人数突破5.3亿例，死亡人数超过6.32万人[1].当前，全球新冠肺炎疫情仍高位流行，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)不断突变，“奥密克戎”变异株传播力明显增强、逃逸能力增加，已取代其他变异株，成为全球绝对优势流行毒株[2].自2022年3月初以来，由境外输入及继发本土传播导致我国出现了新一波新冠肺炎疫情，呈现多点、多源、多链、面广、频发等局面，规模化与散在聚集性疫情并存，已波及我国30个省份，造成重大社会影响.虽然我国坚持“科学精准、动态清零”的防控政策且取得成效，但“外防输入、内防反弹”的疫情防控形势依然严峻复杂，未来依然存在病毒变异、疫情暴发与扩散的巨大风险.
当前，针对新冠肺炎感染者的监测主要依赖“点对点”的“核酸检测+抗原筛查”模式，虽然具有很高的敏感性和特异性，但是预防性大规模人群主动筛查费时、费力、经济成本高、存在漏检可能.因此，建立和开发实时、高效、灵活、经济的新冠肺炎疫情暴发预警机制和监测技术尤为重要.基于污水流行病学方法(wastewater-based epidemiology,WBE)开展污水中新型冠状病毒的监测，因其覆盖人群广泛，可为新型冠状病毒及其变异株的出现、暴发和传播提供早期预警信息，监测人群感染趋势，识别变化拐点，有助于判断新冠肺炎疫情发生、发展动态，提供实时数据与科学依据，辅助政府及相关部门更快、更有效地做出公共卫生决策[3-4].一些国家已在全国范围内系统开展了污水新型冠状病毒监测项目[5]，中国香港地区已实现全港范围的新型冠状病毒常规污水监测[6].随着欧美发达国家临床检测规模日益缩减，WBE正逐步被纳入人群健康监测网络.鉴于此，该文归纳总结了当前全球有关污水新型冠状病毒检测、监测及预警研究的最新进展，分析其实际应用价值与指导意义，为我国下一阶段新冠肺炎疫情或未来其他突发重大疫情的预测预警及精准防控提供借鉴与参考.
1.1 新型冠状病毒赋存特征、环境行为与归宿
新型冠状病毒属于β属冠状病毒，为包膜病毒，与非包膜病毒相比生命周期较短[7].国内外研究发现，新型冠状病毒感染者的尿液、粪便等人体分泌物中可检出大量新型冠状病毒[8-9].新型冠状病毒可侵入肠道系统，破坏其平衡，导致腹泻等症状，腹泻发生率高达49.5%[10]，其在感染者粪便中的持续存活时间为22 d，长于呼吸道的18 d与血清的16 d[11].感染7个月后，粪便中仍可检出新型冠状病毒核酸(简称“病毒核酸”)[12].
新型冠状病毒可通过感染者排遗、排泄、洗漱、游泳、洗衣等方式进入市政管网，再到污水处理厂，经污水处理后最终回到水环境中.该环境行为中存在潜在传输与暴露路径[13].污水中新型冠状病毒至少存在3种不同形式：传染性病毒颗粒、非传染性具有完整的病毒基因组、游离的病毒核酸[14].传染性病毒颗粒的活性比病毒核酸的活性衰减速率快，如20℃污水中病毒核酸活性下降90%需3.3 d，而同样温度污水中传染性病毒颗粒下降90%只需1.6 d[15].
新型冠状病毒在污水中的活性受生物和非生物因素的影响，包括但不限于温度、酸碱度、光照、微生物组成和活性、转移和转化机制、消杀措施等[16].研究表明，新型冠状病毒在水中的存活时间随温度升高而降低，在4℃和26℃的污水中活性下降90%分别需要17.17和8.42 d[17]；
可在pH=3~10的范围内存活至少1 h，极端酸碱性会影响病毒稳定性[18].新型冠状病毒在污水中的稳定性相对较差，容易被灭活，常见的污水处理方法，如使用含氯消毒剂、二氧化氯、过氧化氢、臭氧、紫外线消毒均能有效灭活新型冠状病毒，并在一定程度上影响病毒核酸检出[19].例如，Tomasino等[20]发现，未经处理的污水中可检测到病毒核酸，而经3次处理、紫外线消毒后的污水中并未检测到.目前，尚无从污水中分离培养出新型冠状病毒活病毒或病毒通过污水传播引起感染暴发的报道.
1.2 污水中新型冠状病毒核酸的检出情况及方法
随着全球新冠肺炎疫情持续扩散，国内外关于市政污水与污泥[21]、海水[22]、河水[22]和地下水[23]中检出病毒核酸的报道越来越多.病毒核酸在荷兰、澳大利亚、印度、意大利、西班牙、美国、加拿大、英国、中国等国家的医院、机场、社区、学校宿舍、污水处理厂、飞机、邮轮等的生活污水中均有检出[24].部分国家污水中病毒核酸的检出情况如表1所示.意大利污水样本中最早检出案例可追溯至2019年10月，该区域的污水样本阳性率为11.6%~100%[51]，检出浓度最高达4.6×105copies/mL[52].截至目前，已有至少11种新型冠状病毒关注变异株(variant of interest,VOI)在全球肆虐，其中“奥密克戎”是许多国家的主要变异株，已在暴发区域内污水中大量检出[53].
表1 全球污水中新型冠状病毒的检出情况Table 1 Detection of SARS-CoV-2 in wastewater worldwide
污水中新型冠状病毒经稀释后浓度较低，需富集浓缩以提高检测的灵敏度.常用的富集方法包括超滤、超速离心、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)沉淀、膜吸附等，但不同方法的回收率差异较大.其中，超滤法的回收率为33%~42.6%[54]，PEG沉淀法回收率为0.62%~56.7%[55]，超速离心法回收率为12%[56].核酸定量多基于逆转录-定量聚合酶链反应(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)以及逆转录微滴数字聚合酶链反应(reverse transcriptiondroplet digital polymerase chain reaction,RT-ddPCR)方法，常见扩增基因有开放读码框1a/b(open reading frame 1ab，ORF1ab)、包膜蛋白(envelope protein,E)和核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N)[57].关切变异株(variant of concern,VOC)或关注变异株(variant of Interest, VOI)的监测和确认多基于下一代测序技术(next generation sequencing, NGS)，但并不适用于病毒滴度较低的环境样本.等位基因特异性PCR(AS-PCR)可弥补这一缺点，其操作简便，灵敏度更高[58]，可用于特定VOC或VOI的实时筛查[59].研发自动化和高通量的污水样本采集、富集浓缩、核酸提取及检测的方法，可大幅提高污水中新型冠状病毒的分析效率.
因病毒富集方法回收率样本间差异大，有研究通过添加外源性内参，如牛冠状病毒疫苗、灭活鼠肝炎病毒、噬菌体MS2、装甲病毒颗粒，或利用内源性标志物，如辣椒轻斑驳病毒(pepper mild mottle virus,PMMoV)、人粪便特异性拟杆菌属、交叉装配噬菌体(crAssphage)，估计病毒富集回收率以校正回收率.此外，综合考虑人群的迁移变化，人工甜味剂(acesulfame K)、粪固醇(coprostanol)、血清素代谢物(5-HIAA)等食物源或人源的人群数量标志物可用于校正因周末、节假日期间人群迁移导致的病毒滴度的差异.例如，D"aoust等[60]发现，经PMMoV校正后，可改善污水中N基因丰度的变化趋势与临床病例数据之间的相关性；
Reynolds等[61]发现，与PMMoV和crAssphage相比，coprostanol作为内参时，污水中病毒核酸浓度与实际病例之间的相关性最强.但由于人群数量标志物受其环境行为、人群的健康状况和生活习惯等影响，需综合污水质量化学数据和多标志物指标对污水病毒核酸滴度进行数据分析，从而减少分析结果的不确定性，提升核酸浓度与新冠肺炎发病率相关性分析的可靠性[37].
2.1 全球污水新型冠状病毒监测项目与进展
基于全球污水中病毒核酸检出的报道及相关研究进展，自2020年2月起，澳大利亚、欧盟26国(包括奥地利、比利时、德国、意大利等)、美国、加拿大、荷兰、土耳其、中国香港等多个国家或地区已开展或计划开展针对新型冠状病毒的全国或局部水环境监测.在过去的两年多内，全球开展污水新型冠状病毒监测项目的国家已达67个，参与的高校与科研院所已达279个，监测点位3 393个[62]，主要集中在新冠肺炎疫情较为严重的欧美澳等发达国家与中国香港地区.例如，自2020年9月美国国家污水监测系统(national wastewater surveillance system, NWSS)启动后，已有37个州、4个城市和2个地区的公共卫生部门在400多个点位开展污水监测活动，已采集34 000多份污水样本[63].中国香港已设置112个常规采样点，覆盖530万人口[6].监测项目从污水处理厂及居民社区收集污水样本，对其进行检测与分析，实时将监测结果反馈给公共卫生决策部门并向公众公开，为覆盖地区提供新冠肺炎疫情信息，使当地政府能够更快、更有效地采取应对措施.部分代表性国家的污水新型冠状病毒监测项目见表2.
表2 全球已开展的代表性污水监测项目Table2 Representative global wastewater surveillance projects
2.2 开展污水新型冠状病毒监测的价值与意义
2001年，污水流行病学由美国环境保护局的科学家Christian G.Daughton博士率先提出[71]，通过检测污水中目标化学或生物标志物的浓度，结合人体代谢、进水流量、输送效率、服务人群等信息，反推获得覆盖区域内人群活动或健康状况的定性和定量数据的一种监测方法.由于具有覆盖范围广、可扩展、成本效益高等优势，已被一些国家应用于追踪药物(如可卡因、甲基苯丙胺、抗生素)滥用情况、监测传染性病原体(如诺如病毒、脊髓灰质炎病毒、多重耐药性细菌等)，以及评价相关疾病流行程度与疫苗接种情况等方面，为进一步指导疾病防控和健康决策制定提供科学有效的手段.开展污水新型冠状病毒监测工作具有以下实际价值：
a)WBE监测范围大、成本低，可作为人群监测的重要补充.污水覆盖区域广、人口基数大，可涵盖未能及时进行核酸、抗原或抗体筛查的人群或无症状感染者.因此，进厂水或街道社区污水的病毒核酸检测可作为人群新冠肺炎动态监测(如哨点监测、发病率监测、临床监测)的辅助补充[72].新冠肺炎疫情暴发后，有些国家和地区，尤其是中低收入国家的核酸检测试剂盒和检测设备供应紧张，检测能力和人员不足，大规模人群主动筛查实施较为困难，而污水监测作为一种“点对面”、快速、“非侵入性”的方法，不会占用过多资源，节约人力、时间和经济成本.即使在患病率较低的情况下，污水监测仍具有较高的灵敏度，为1~10人/(105人)[52].同时，污水监测不涉及个人隐私，社会伦理学代价低.
b)为新型冠状病毒的出现和新冠肺炎疫情的暴发提供预警信息.多个国家对污水中病毒核酸开展时空监测，发现病毒核酸检出早于发现当地确诊病例2~63 d[73]，提示污水监测作为新冠肺炎疫情暴发预警的可行性和时效性.例如，美国多所大学(包括亚利桑那大学等)对学生宿舍污水进行检测，发现并隔离多名无症状感染者[74]；
中国香港根据社区污水新型冠状病毒阳性检测结果，发现“德尔塔”变异株并采取措施，避免了一次由其引发的新冠肺炎疫情[6].因此，开展污水新型冠状病毒监测，能早期识别病毒的出现，预判新冠肺炎疫情暴发流行的时间起点，判断特定区域的病毒传播程度，提前采取干预措施(如主动核酸筛查和居家隔离)，提升精准防控水平，从而遏制病毒传播，降低新冠肺炎疫情的不利影响.
c)突变检测能用于新型冠状病毒变异株的筛查、定量与溯源.对新型冠状病毒单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)突变的扩增测序和系统发育分析可快速识别污水中的变异株[75]，了解病毒基因组的变异信息[76].例如，香港大学张彤教授团队从污水中检出变异株，早于临床发现确诊病例3 d[77]；
抵达澳大利亚的国际航班污水中检出“奥密克戎”变异株，与实际病例的基因组测序结果一致[78]，有助于快速筛查新型冠状病毒感染情况.因此，应用AS-PCR或高通量测序技术开展污水中病毒核酸的突变检测与分析，能够筛查并定量VOC和VOI，发现新的病毒变异株，判断病毒进化起源，有利于开展病毒溯源与新冠肺炎疫情研判分析，指导疫情精准防控.
d)预估与追踪感染人数和新冠肺炎疫情规模，评估干预措施有效性.结合人体代谢、进水流量和服务人群数量等人口学及基础信息资料，建立预测预警模型，反推病毒在监测覆盖区域内的传播状况、估算感染人数[79]，有助于及时掌握新冠肺炎疫情发生、发展动态，提供防控建议.例如，西班牙开发了一种回归模型估计包括无症状感染者在内的感染人数，其估算的感染人数(1 661人)与实际病例数接近(1 667人)[80]；
荷兰水循环研究所联合英国、希腊和西班牙研究人员研发污水新型冠状病毒监测模型“Sewers4COVID”，结合污水流行病学和机器学习，可快速、经济、高效地监测全国范围内的新冠肺炎疫情暴发热点，预测大流行的暴发[67].污水病毒载量与人群疫苗接种率相结合，可确认疫苗的有效性[81]，污水中病毒核酸检出浓度的下降，可为解除社交限制和隔离等防控措施提供支持.例如，美国印第安纳州一项研究发现辉瑞疫苗接种后，污水病毒核酸浓度显著下降，且连续12 d污水固体中未检出病毒核酸[82].
3.1 污水中新型冠状病毒的分布特征及感染性缺乏足够研究
当前对污水新型冠状病毒的监测、流行病预测预警模型的开发与应用，在很大程度上受污水中病毒的完整性、基因组或核酸片段的持久性、病毒传染性等方面的限制[83].感染者粪便中病毒载量、每天排便量、污水流量、下水道传输效率等不确定因素均会造成污水样品采集和检测准确性的偏移，难以反映真实的病毒载量、人群感染比例与新冠肺炎疫情的变化趋势.与此同时，由于污水基质较为复杂，难以分离培养其中的活病毒，关于污水中新型冠状病毒活性、传染力的机制仍不清楚，新型冠状病毒是否可通过水环境传播导致暴发尚缺乏足够的科学证据.
3.2 污水中新型冠状病毒的富集浓缩及检测方法亟待标准化
由于污水中新型冠状病毒浓度较低以及方法本身的局限性，如何准确、灵敏、高通量、低成本地采集、富集浓缩与检测污水中的病毒核酸依然面临巨大挑战.现阶段核酸富集浓缩与检测方法存在以下差异：一是既往大多数监测针对污水的液相部分进行病毒核酸提取和检测，忽略了固相悬浮物吸附的病毒颗粒；
二是浓缩方法、核酸提取和检测方法的灵敏度、特异性、安全性亟待进一步解决.由于病毒核酸极不稳定，在污水中会被高度稀释和降解，获得较为完整的基因组序列相当困难[84].针对新型冠状病毒WBE现有的文献多集中于优化样品收集和处理上，而缺少污水采样方案设计的研究.目前，全球缺乏统一的标准方法来监测污水中的新型冠状病毒，包括从污水采集、保存、运输、预处理、富集浓缩、核酸提取、检测分析到最终的数据解读，以及全过程的质量控制，这些环节均对最终结果的科学性和有效性至关重要.
3.3 污水新型冠状病毒的预测预警模型开发与应用的局限性
由于污水监测采用的是“点对面”的预测模式，从污水管网末端采样，要实现病例的精准追踪和感染规模的精确评估预测预警能力较为困难，特别体现在：①污水管网覆盖监测人群区域的比例对于结果准确性(漏检)的影响.②清洁剂、消毒剂等日化用品的使用和消杀措施等对病毒颗粒或核酸稳定性造成的影响.③检测方法灵敏度的限制，因为低于检出限的阴性结果并不等于零病例.④对于预测预警模型建立的制约，体现在不同变异株病毒载量和脱落率的差异性等.⑤新型冠状病毒的排遗特征数据不足，缺乏各年龄组、性别组、感染的病毒变异株组和感染/疾病进展中的病毒携带载量和排出量数据.解决上述问题：首先，需要了解感染者粪便中病毒核酸载量，确保污水样本对目标人口的代表性，明确病毒在污水中的稀释情况及检出限；
其次，需要完善的污水收集处理管网，根据实际需求进行灵活的采样设计，如从上游至下游的全覆盖监测策略或针对热点区的重点监测策略；
最后，需要与流行病学家、环境工程师和公共卫生人员等密切合作.
我国幅员辽阔，人口众多，污水监测可作为目前新冠肺炎监测体系的重要补充，实时掌握全国重点地区和重点场所的污水中新型冠状病毒分布特征和新冠肺炎疫情发生发展动态，特别是有助于无症状感染者的早期发现.对污水病毒核酸阳性区域进行风险级别研判，开展核酸序列突变监测，通过污水管网回溯提示污水处理厂覆盖社区和居民病毒变异株的感染情况，在空间上缩小调查与筛查范围，节约人力、时间与经济成本，提升精准防控水平.我国可循序渐进开展以下工作：
a)建立标准，形成污水新型冠状病毒及变异株的检测技术规范.2022年3月24日，国家卫生健康委员会发布了WS/T 799−2022《污水中新型冠状病毒富集浓缩和核酸检测方法标准》，明确相关具体操作规程，为我国污水新型冠状病毒监测提供了重要依据和技术指导.但是，针对全球范围出现的高度传播的新型冠状病毒变异株，仍需建立新的检测技术方法，快速鉴定并追踪不同的病毒变异株以及新出现的变异株，便于及时采取应对措施.
b)合理应用，为未来新冠肺炎疫情的再次暴发做好技术与应用储备.目前我国一些地区已初步开展了污水流行病学的研究应用.例如，广东省疾病预防控制中心开展污水中诺如病毒监测，提前1~2个月发现诺如病毒变异株[85]；
中国疾病预防控制中心病毒病所在新疆的污水样本中发现星状病毒等[86]；
中国疾病预防控制中心环境所联合当地疾控对云南省某市新冠肺炎患者救治医院、隔离点等高风险场所的污水、河流水体等进行检测，发现医院污水中新型冠状病毒检出率为100%；
中国疾病预防控制中心传染病所联合新疆当地疾控在南疆伤寒流行热点地区开展医院污水检测，分离到伤寒沙门菌，从而提示住院患者中存在伤寒病人，为临床诊断提供方向；
香港大学在社区污水中检出病毒核酸[50]，发现多名无症状感染者.因此，选择重点边境口岸地区或高风险场所开展污水监测，基于现有的基础设施及技术，在新冠肺炎疫情防控过程中不断探索优化监测方案，特别是采样点位、采样时间和采样频次的设置，获取实际应用经验.
c)科学布局，逐步形成全国范围的污水中病原体监测网络.我国尚未建立系统性、全国性的污水流行病学监测网络，严重制约着污水预测预警模型研究.但是，我国的城市排水系统管网在不断优化改进，截至2020年，我国有城市污水处理厂2 618座，县城污水处理厂1 708座，覆盖31个省(直辖市、自治区)[87]，城市污水收集覆盖率已达95%，为建立全国性的监测网络奠定了基础.污水新型冠状病毒监测需多学科、多部门密切协作，建立健全工作机制，逐步推广形成全国性的监测网络.污水监测同样适用于其他病原体(如脊灰病毒、流感病毒、诺如病毒、轮状病毒、霍乱弧菌、沙门菌、结核分枝杆菌等)，实时掌握污水中病原体分布特征信息，了解其在我国人群中的流行特征及动态变化，助力于我国传染病智慧化预警多点触发机制和多渠道预测预警机制.
d)优化模型，为新冠肺炎疫情及其他传染病流行预警提供依据.打通部门、机构间信息壁垒，实现污水中病毒核酸浓度和基因组序列的监测数据、新冠肺炎疫情流行病学数据和医疗机构的临床监测数据等多元信息系统整合，运用机器学习、深度学习等人工智能技术，可建立新冠肺炎疫情预测预警模型，估计感染规模.不断利用多维度的监测数据优化模型，形成智能化信息数据管理系统及大数据共享网络，一方面应用于新型冠状病毒监测，另一方面也为将来基于污水流行病学的病原体监测网络提供预测预警技术平台，将极大提升我国应对传染病及非传染病的预测预警、流行规模评估及精准施策的能力.
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