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吴会会， 杨珺， 曾炫富， 王娅， 王胜军,， 马永明
(1. 江苏大学医学院，江苏 镇江 212013；
2. 江苏大学附属人民医院耳鼻咽喉头颈外科，江苏 镇江 212002；
3. 江苏大学附属人民医院检验科，江苏 镇江 212002)
慢性鼻窦炎伴鼻息肉(chronic sinusitis with nasal polyps，CRSwNP)是多种炎性细胞参与并累及鼻腔和鼻窦黏膜的慢性炎性疾病，主要采用手术切除及辅以术后药物治疗，然而由于CRSwNP的具体发病机制不明，鼻息肉术后复发一直是困扰耳鼻喉科医生的难题。CRSwNP最显著的病理学特征是炎性细胞大量浸润，其中约20%的细胞是嗜酸性粒细胞，相关研究显示B细胞、浆细胞、特异性IgE在鼻息肉组织中表达上升[1-2]。
髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)是一类骨髓来源的、不成熟的且具有高度异质性的细胞群体，参与癌症、慢性炎症、感染、创伤、自身免疫性疾病、移植物抗宿主病等多种疾病的发生发展[3-5]。MDSCs在慢性炎症条件下持续产生炎性细胞因子、趋化因子和生长因子，IL-6可通过STAT3依赖性机制上调MDSCs中趋化因子受体5(chemotactic cytokine receptor-5，CCR5)和精氨酸酶-1(arginase-1，ARG-1)的表达[6]。MDSCs根据表面标志的不同分为HLA-DR-CD11b+CD33+MDSCs或HLA-DR-CD11b+CD33+CD14-CD15+粒细胞性MDSCs(PMN-MDSCs)，以及HLA-DR-CD11b+CD33+CD14+CD15-单核细胞性MDSCs(M-MDSCs)两个亚型[7-8]。免疫抑制是MDSCs的主要特征，MDSCs介导的免疫抑制包括ARG-1、诱导型一氧化氮(iNOS)、活性氧和程序性细胞死亡配体1。MDSCs大量产生iNOS和ARG-1，通过促进NO和活性氧产生而直接抑制T细胞功能[9]，而且其产生的ARG-1消耗精氨酸，使T细胞信号转导障碍[10]。也有研究表明，在系统性红斑狼疮中MDSCs依赖ARG-1促进Th17细胞的分化[11]。本研究拟探讨MDSCs是否参与了CRSwNP的发病过程，具体是哪一亚群参与了这一过程。
1.1 临床血液标本
收集2020年5月至2021年6月江苏大学附属人民医院耳鼻咽喉头颈外科收治的CRSwNP患者31例，其中男20例，女11例，年龄17～76岁，平均49.37岁。所有患者均依据中国慢性鼻窦炎诊断和治疗指南(2018)[12]的诊疗标准明确诊断为CRSwNP，患者在门诊行鼻内镜检查，鼻窦CT薄层平扫确诊为CRSwNP。所有纳入研究的患者至少在手术前3个月内停用全身糖皮质激素，手术前1个月内停用鼻用糖皮质激素以及抗白三烯药物。36例经鼻窦薄层CT平扫确定无鼻窦炎鼻息肉的健康受试者被纳入作为对照组，其中男20例，女16例，年龄20～79岁，平均44.50岁。取对照组和患者的EDTA抗凝外周静脉血样本，由于标本的采集时间跨度较大，因此并非每个标本都进行了所有实验。本研究通过医院伦理委员会审核，受试者均签署知情同意书。
1.2 主要试剂与仪器
流式抗体抗人HLA-DR(PE-Cy7)、抗人CD11b(Brilliant Violent 510TM)、抗人CD33(FITC)、抗人CD14(APC)、抗人CD15(PE)(美国Biolegend公司)；
抗人ARG1(PE)(英国eBioscience公司)；
样本密度分离液(天津灏洋华科生物科技有限公司)；
细胞内固定缓冲液、破膜缓冲液(美国Thermo Fisher公司)；
人IL-6 ELISA试剂盒(南京福麦斯生物科技有限公司)；
超速离心机、流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司)；
酶标仪(美国Thermo Fisher公司)。
1.3 提取外周血单个核细胞和血浆
取2 mL新鲜外周血(EDTA抗凝)，采用样本密度分离液分离得到外周血单个核细胞和血浆，外周血单个核细胞立即进行实验，血浆存放于-80 ℃短期保存。
1.4 流式细胞术检测MDSCs比例
调整单个细胞悬液细胞数量为106/100 μL缓冲液，加入单克隆HLA-DR(PE-Cy7)、CD11b(Brilliant Violent 510TM)、CD33(FITC)、CD14(APC)、CD15(PE)流式抗体，4 ℃条件下避光孵育30 min，再加入1 mL PBS清洗2遍，500×g离心10 min，200 mL PBS重悬细胞，上机检测目的细胞比例。
1.5 流式细胞术检测MDSCs细胞内ARG-1的表达水平
调整单个细胞悬液细胞数量为106/100 μL缓冲液，加入单克隆HLA-DR(PE-Cy7)、CD11b(Brilliant Violent 510TM)、CD33(FITC)流式抗体，4 ℃条件下避光孵育30 min，再加入1 mL PBS清洗2遍，以300×g离心10 min，加入500 μL固定缓冲液，混匀，室温条件下避光孵育15 min后，加入1 mL破膜缓冲液清洗2遍，300×g离心5 min，弃上清液，用50 μL破膜缓冲液重悬，加入抗人ARG-1(PE)，4 ℃条件下避光孵育30 min，再加入1 mL PBS清洗2遍，500×g离心10 min，200 μL缓冲液重悬细胞，上机检测HLA-DR-CD11b+CD33+总MDSCs细胞内ARG-1细胞的表达情况。
1.6 ELISA检测CRSwNP患者血浆IL-6的浓度
取-80 ℃条件保存的血浆100 μL，放至室温，用IL-6 ELISA试剂盒检测CRSwNP患者血浆IL-6的浓度，按照说明书的步骤进行操作，在酶标仪上450 nm处读取各孔的光密度值，根据绘制的标准曲线换算后得到血浆IL-6浓度值，每组重复3次取平均数为检测结果。
1.7 统计方法
2.1 CRSwNP患者外周血总MDSCs和PMN-MDSCs的比例升高，G-MDSCs的比例降低
CRSwNP患者外周血HLA-DR-CD11b+CD33+MDSCs细胞的比例(1.20%±0.92%)与对照组(0.49%±0.59%)相比显著升高，差异有统计学意义(t=3.77,P<0.01)；
CRSwNP患者HLA-DR-CD11b+CD33+CD14-CD15+PMN-MDSCs的细胞比例(56.52%±24.63%)与对照组(39.97%±26.86%)相比显著升高，而HLA-DR-CD11b+CD33+CD14+CD15-M-MDSCs细胞比例(16.82%±14.71%)与对照组(25.77%±19.97%)相比显著降低，差异均有统计学意义(t=2.59,t=2.01,P均<0.05)。见图1。
图1 MDSCs及其亚群在外周血中的变化
2.2 CRSwNP患者外周血总MDSCs中ARG-1的表达增加
CRSwNP患者外周血总MDSCs中ARG-1的平均荧光强度(4 455±1 476)与对照组(2 584±1 151)相比显著升高，差异有统计学意义(t=2.81,P<0.05)。见图2。
图2 总MDSCs细胞内ARG-1的表达
2.3 CRSwNP患者血浆IL-6的浓度升高
CRSwNP患者血浆中IL-6浓度(15.48±8.54) pg/mL与对照组(8.27±3.49) pg/mL比较显著升高，差异有统计学意义(t=2.24,P<0.05)。见图3。
图3 血浆中IL-6浓度比较
CRSwNP是耳鼻咽喉头颈外科的常见病、多发病，虽然近年来对CRSwNP的研究取得了较大进展，但对其确切的发病机制仍知之甚少[13]。CRSwNP作为慢性鼻窦炎的一种类型，其发病或复发与病原微生物的感染、过敏性鼻炎、鼻腔结构不良、纤毛功能不良、免疫功能异常等多种因素有关。目前研究表明CRSwNP具有高度的异质性，不同种族、国家乃至不同地区的CRSwNP具有不同的免疫病理学特点[14]。CRSwNP病理生理学基础是一种Th2主导的、持续的嗜酸性粒细胞炎症，虽然目前一般认为在白种人中Th2细胞因子环境以及组织的嗜酸性粒细胞浸润是其主要病理特点，但在中国仍有将近一半的CRSwNP患者表现为Th2细胞因子环境以及嗜酸粒细胞性炎症[15-18]。
关于MDSCs的报道始于20世纪70年代，Fu等[19]研究表明，各种类型的髓样细胞可以抑制癌症的免疫功能。但是，这些细胞的具体性质和生物学意义在很大程度上仍不清楚。有研究认为Gr1+CD11b+细胞表型定义了小鼠脾脏中的免疫抑制髓系细胞，然而很快就发现CD11b+Gr-1+细胞是异质性的。不同的表型标准和多种作用机制被用来定义这些细胞。2000年，为了统一对这些细胞的描述，提出了MDSCs这个名称。MDSCs在健康条件下无法检测到，但在怀孕期间、新生儿和病理情况下(如肿瘤或慢性感染)可检测到[20]。MDSCs是慢性炎症的标志，可以提高癌症患者对免疫治疗的耐受力，因此消除MDSCs是目前的共识，并且在肿瘤的免疫治疗中靶向MDSCs取得了令人欣喜的进展[21]。
本研究通过流式细胞术检测发现CRSwNP患者外周血中总MDSCs和PMN-MDSCs细胞比例明显升高，而M-MDSCs细胞比例显著降低，进一步通过酶联免疫吸附技术检测发现CRSwNP患者血浆IL-6浓度显著升高。推测造成这一现象的原因可能是当机体处于慢性炎症的病理环境下，包括IL-6在内的细胞因子或炎症因子大量产生，这些细胞因子不仅可以阻滞不成熟髓系细胞的正常分化，还能诱导其成为MDSCs，并在患者外周血、骨髓或肿瘤组织内大量募集、扩增、活化，通过抑制特异性免疫和非特异性免疫发挥其免疫抑制作用[22]。也有研究表明在肿瘤微环境中，MDSCs可与T细胞竞争使用对T细胞激活和增殖至关重要的半胱氨酸，导致T细胞不能从头合成，从而阻碍抗肿瘤T细胞的产生，促进肿瘤的进展[23-24]。IL-6是参与MDSCs分化的重要细胞因子，有研究表明与没有IL-6参与分化的MDSCs相比，在IL-6存在下分化的MDSCs有更强的抑制CD8+T细胞的功能[6，25]。研究表明MDSCs产生ARG-1，ARG-1既可以通过促进产生活性氧而直接抑制T细胞功能，又可以消耗精氨酸，使T细胞信号转导障碍，而通过流式细胞术进行细胞内染色发现总MDSCs细胞内ARG-1的表达明显升高。因此推测在鼻息肉的长期慢性炎症刺激下，MDSCs通过产生ARG-1促进活性氧的产生，进而抑制T细胞的功能。由于条件限制，本课题只研究了总MDSCs中ARG-1的表达情况，没有进一步研究是MDSCs的哪一亚群的变化导致ARG-1的升高。
机体在CRSwNP的长期慢性炎症刺激下产生IL-6等炎症因子，导致MDSCs的分化增多，增多的MDSCs通过产生ARG-1从而抑制T细胞的免疫功能，而鼻黏膜在长期慢性炎症的刺激下导致了鼻息肉的形成。课题组将进一步完善相关分子机制的研究，为CRSwNP的干预治疗提供实验依据。
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