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李辉龙，万禄明，杨欢，彭雨蒙，王化鹏，韦猛，莫运海，徐艺心，魏从文，钟辉，吴飞翔，4，5
1.广西医科大学附属肿瘤医院 肝胆外科，广西 南宁 530021；
2.军事医学研究院 生物工程研究所，北京 100071；
3.空军军医大学 基础医学院，陕西 西安 710032；
4.广西肝癌诊疗工程技术研究中心，广西 南宁 530021；
5.区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室，广西 南宁 530021
糖尿病是全球公共卫生问题，也是全球第七大死亡原因。其特征是机体长时间处于高血糖状态，如果不及时治疗，糖尿病会引起许多并发症。严重的长期并发症包括心血管疾病、中风、慢性肾脏病、足部溃疡、神经系统损伤和认知障碍等[1]。机体通过复杂的激素反馈机制将血糖控制在狭窄的范围，这种严格的调节称为葡萄糖稳态[2]。降低血糖的胰岛素和升高血糖的胰高血糖素是其中最主要的激素[3]。当血糖处于低水平时，胰腺释放胰高血糖素（glucagon，GCG），后者通过促进糖原异生和糖原分解来升高血糖[4]。在短期饥饿中，机体主要通过肝脏糖原的分解来维持血糖平衡；
而在长期禁食期间，随着糖原储存的逐渐消耗，糖原分解的贡献逐渐减少，此时肝脏中糖异生的贡献逐渐增加[5]。在GCG介导下，细胞内环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）积累并诱导cAMP依赖性蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）激活，进而触发酶和调节蛋白的磷酸化[6]。然而，肝脏糖异生过程处于异常激活状态时，会增加肝糖输出，导致血糖升高，这种长期的高血糖状态可对机体组织造成损伤，引起胰岛素敏感性降低，进一步形成糖尿病[7]。
肝脏是药物代谢、生物转化和各种生物分子储存的主要器官[8]。原代肝细胞是体内肝细胞的良好代表，是在体外研究肝功能的有用工具，如基因表达的变化、内源性物质的代谢以及外源性药物的药理特性，新分离的肝细胞比肝脏来源的细胞株更能反映正常肝脏在体内的功能[9]。原代肝细胞的分离方法包括非灌流的机械分离法、胰酶消化法和胶原酶消化法，采用灌流的离体胶原酶灌流法、Seglen两步灌流法、下腔静脉逆向胶原酶灌流法和Gerlach五步胶原酶灌流法。迄今，Seglen两步灌流法是分离大量高活性原代肝细胞的首选方法。在第一步中，含EGTA的无钙灌注液迅速破坏细胞间连接，第二步用胶原酶破坏支持肝实质细胞结构的细胞外基质[10]。该分离方法是利用动物自身的循环系统通过肝门静脉向肝脏灌注的技术[9]。该方法能够减少分离过程中肝细胞的损伤，尚存在灌流针易掉出导致组织消化不充分、细胞提纯过程中细胞死亡等问题，仍有待改善实验技术，进一步提高肝细胞的活率并维持细胞形态。本实验在Seglen两步灌流法分离小鼠原代肝细胞的基础上，进一步完善实验技术，用糖原染色鉴定原代肝实质细胞，通过细胞对胰高血糖素的响应，进而表现出细胞糖异生葡萄糖的产出水平变化，关键酶基因的表达差异以及cAMP-PKA系统的应答反应，建立小鼠原代肝细胞糖异生研究模型。
1.1 材料
6只8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠，体重18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号为SCXK2020-0006。小鼠饲养于相对湿度40%～70%、温度20～25℃的环境中，实验前适应性饲养7 d。
Hank′s缓冲盐溶液和BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Beyotime公司；
EGTA购自Meilunbio公司；
Ⅳ型胶原酶购自Biofroxx公司；
低糖DMEM和无糖DMEM购自Solarbio公司；
DMEM/F-12购自Biosharp公司；
胎牛血清（FBS）购自Thermo Fisher Scientific公司；
丙酮酸钠和乳酸钠购自Sigma公司；
胰高血糖素购自MedChemExpress公司；
cAMPS-Rp购自Tocris公司；
二甲基亚砜（DMSO）购自Innochem公司；
葡萄糖产出检测试剂盒购自Invitrogen公司；
NucleoZOL购自Macherey-Nagel公司；
RNA逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂购自TransGen Biotech公司；
PKA激酶活性检测试剂盒和cAMP检测试剂盒购自Abcam公司；
qRTPCR引物由北京擎科生物科技有限公司合成。
密闭式静脉留置针购自BD公司（Becton，Dickinson and Company）；
实时荧光定量PCR仪和恒温培养箱购自Thermo Fisher Scientific公司；
倒置显微镜购自Nikon公司；
全自动酶标仪购自Tecan公司；
低温高速离心机购自北京大龙兴创实验仪器公司；
PCR仪购自北京东胜创新生物科技有限公司。
1.2 分离小鼠原代肝细胞
两步灌流法分离小鼠原代肝细胞。取8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠，禁食12 h后用10%水合氯醛麻醉，腹部向上胶带固定四肢，将小鼠固定于吸水工作台垫上，75%乙醇彻底清洁腹部和胸部区域；
用剪刀和直钳取下腹部切口，剪开表皮和肌肉层，暴露肝脏，用平口镊将腹部脏器向右外侧牵拉，充分暴露并识别肝门静脉与下腔静脉；
启动蠕动泵，密闭式静脉留置针前端有液体缓慢流出后，伴随液体的流出迅速将留置针置入肝门静脉，用37℃温浴的前灌流液进行灌注，剪断下腔静脉释放灌注压力，灌注体积为75 mL/只；
更换含Ⅳ型胶原酶的低糖DMEM消化液继续缓慢灌注，灌注体积为75 mL/只；
待肝脏胶原结构充分消化后，快速切取整个肝脏于含有10 mL DMEM分散液的10 cm培养皿中；
更换至生物安全柜中，按照严格的无菌要求，用无菌直镊撕裂肝叶，使肝实质细胞充分游离于分散液中，加入10%胎牛血清以保持肝细胞活力，用10 mL移液管吹打肝细胞悬浮液后，用70～75 μm过滤网过滤细胞悬浮液于50 mL锥形管中；
在荡平式离心机中以4℃、50 r/min离心2 min，去除上清并用含10%胎牛血清的低温DMEM/F-12洗涤液重悬细胞洗涤，重复离心洗涤4次去除间质细胞和细胞碎片；
最后一次离心完成后，吸弃上清，即得小鼠原代肝细胞。
1.3 小鼠原代肝细胞培养
向获得的小鼠原代肝细胞沉淀中加入25～50 mL DMEM培养基（含10% FBS，1%青霉素-链霉素）并重悬、混匀细胞，按密度4.5×108/L平均铺板于6孔细胞培养板，在37℃、5% CO2恒温培养箱中培养6～8 h使细胞充分贴壁，吸弃旧培养基，PBS洗涤一次，更换成无血清DMEM培养基继续培养以充分保持细胞形态和活力，细胞贴壁后，糖原染色鉴定小鼠原代肝细胞，在倒置显微镜下观察细胞生长形态。
1.4 葡萄糖产出检测
细胞培养24 h后，更换成含10 mmol/L丙酮酸钠和10 mmol/L乳散钠的无糖无酚红DMEM培养基，37℃培养箱孵育4 h后，收集细胞上清于1.5 mL离心管中，1500 r/min离心3 min，收集上清液，尽量避免吸到管底细胞碎片沉淀，上清采用葡萄糖检测试剂盒检测葡萄糖产出量，并利用相应蛋白质含量将数据标准化。
1.5 蛋白提取
吸弃培养基，用PBS洗涤2次，加入NP40裂解液，反复吹打细胞使细胞全部脱落，收集细胞悬液于1.5 mL离心管中，置于冰上裂解10 min，4℃、12 000 r/min离心10 min，收集上清液，BCA法测定蛋白质浓度。
1.6 RNA提取
吸弃培养基，PBS洗涤2次，在小鼠原代肝细胞样品中加入适量NucleoZOL细胞裂解液，吹打细胞使之全部脱落，收集裂解液于1.5 mL离心管，放至匀浆机涡旋振荡充分裂解细胞，用异丙醇有机试剂沉淀核酸，75%乙醇洗涤核酸沉淀，根据RNA沉淀量多少加入焦碳酸二乙酯（DEPC）水充分溶解，获得纯度及完整性较高的RNA样本。
1.7 实时荧光定量PCR
如前所述，用NucleoZOL试剂从细胞中提取总RNA，用RNA逆转录试剂盒将1 μg纯化的RNA逆转录为cDNA，采用实时荧光定量PCR仪，利用特异性引物进行定量检测。结果采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。
1.8 PKA活性检测
吸弃培养基，PBS洗涤2次，用配制的细胞裂解液充分裂解细胞，收集裂解液于1.5 mL离心管中，用PKA活性检测试剂盒测定PKA活性，并利用相应蛋白质含量将数据标准化。
1.9 cAMP含量检测
吸弃培养基，PBS洗涤2次，用配制的细胞裂解液充分裂解细胞，收集裂解液于1.5 mL离心管中，用cAMP含量检测试剂盒测定cAMP活性，并利用相应蛋白质含量将数据标准化。
1.10 统计学处理
用GraphPad软件进行统计学分析，计量数据以x±s表示，采用非配对样本的双尾t检验和多因素方差分析对不同组数据进行比较。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 小鼠原代肝细胞分离
分离小鼠原代肝细胞后24 h，在倒置显微镜下观察细胞形态并进行糖原染色（图1）。细胞贴壁良好，具有典型的肝细胞形态，可见双核，呈多边形，且细胞相互接触，排列成肝索样结构。
图1 分离的小鼠原代肝细胞
2.2 胰高血糖素通过促进小鼠原代肝细胞糖异生产生葡萄糖
小鼠原代肝细胞分离后，细胞存活率高，形态完整，可进行下一步实验。为检测小鼠原代肝细胞是否具有糖异生能力，并优化糖异生研究模型，我们将培养24 h的细胞分成DMSO对照组和GCG实验组。结果显示，与DMSO对照组相比，GCG实验组0 h糖异生葡萄糖产出量无明显变化，GCG作用1、2、4和8 h细胞糖异生葡萄糖产出量显著增加（P＜0.001，图2A）。同时检测了不同浓度GCG作用4 h后小鼠原代肝细胞糖异生葡萄糖的产出量，结果显示，与DMSO对照组相比，100、250、500、1000和2000 nmol/L GCG作用下，细胞糖异生葡萄糖产出量显著增加（P＜0.001，图2B），GCG浓度为0～1000 nmol/L时葡萄糖产出量呈剂量依赖性，GCG浓度高于1000 nmol/L后葡萄糖产出量达到平台期。
图2 GCG作用下小鼠原代肝细胞葡萄糖产出水平
2.3 胰高血糖素上调小鼠原代肝细胞糖异生关键酶基因表达
GCG能够促进小鼠原代肝细胞糖异生产生葡萄糖，并呈时间依赖和剂量依赖。为了进一步研究GCG如何促进小鼠原代肝细胞糖异生产生葡萄糖，我们检测了在GCG作用下细胞糖异生关键酶基因mRNA的相对表达量。结果显示，与对照组相比，GCG作用后小鼠原代肝细胞的Pcx、Fbp1、Pck1和G6pc等糖异生关键酶基因mRNA表达量显著增加（P＜0.001，图3A）。同时检测了细胞糖酵解关键酶基因mRNA的相对表达量，结果显示，与对照组相比，GCG作用后小鼠原代肝细胞的Hk2、Pkm和Pfkl等糖酵解关键酶基因mRNA表达量下降（P＜0.001，图3B）。最后，我们还检测了糖原分解和糖原合成关键酶基因的相对表达量，结果显示，与对照组相比，GCG作用后小鼠原代肝细胞糖原分解关键酶基因Pygl的mRNA表达量显著增加（P＜0.001，图3C），而糖原合成关键酶基因Gys2的mRNA表达量显著下降（P＜0.001，图3D）。
图3 GCG作用下小鼠原代肝细胞糖代谢关键酶基因的mRNA相对表达量
2.4 胰高血糖素上调小鼠原代肝细胞cAMP水平
GCG上调小鼠原代肝细胞糖异生关键酶基因Pcx、Fbp1、Pck1和G6pc的mRNA表达，基因表达受上游信号分子调控，其中cAMP发挥关键作用。为了进一步研究GCG促进细胞糖异生的作用机制，我们检测了在GCG作用下细胞cAMP的水平，结果显示，与DMSO对照组相比，GCG实验组小鼠原代肝细胞cAMP水平显著上升（P＜0.001，图4A）。同时检测了添加cAMP抑制剂后GCG作用的细胞葡萄糖产出水平，实验分为DMSO、GCG、GCG和cAMPS-Rp等3组。与GCG组相比，同时加GCG和cAMP-Rp组葡萄糖水平显著下降（P＜0.001，图4B），与加DMSO对照组葡萄糖水平相近，表明GCG通过cAMP信号通路促进小鼠原代肝细胞糖异生。我们还检测了GCG作用下小鼠原代肝细胞PKA活性，结果表明，与DMSO对照组相比，GCG组小鼠原代肝细胞PKA活性显著提高（P＞0.001，图4C）。
图4 GCG作用下小鼠原代肝细胞cAMP和PKA活性
哺乳动物禁食期间，糖异生过程被激活产出葡萄糖以维持机体血糖稳定在狭窄的范围内，其中肾脏的贡献值为10%，而肝脏的贡献值达到90%[11]。GCG与位于细胞质膜上的GCG受体（一种G蛋白偶联受体）结合，受体的构象变化激活了G蛋白，G蛋白是具有α、β和γ亚基的异源三聚体蛋白[12]。当GCG与受体的G蛋白相互作用时，导致该异源三聚体蛋白从β和γ亚基释放α亚基，α亚基特异性激活级联反应中的下一个酶——腺苷酸环化酶[13]，该酶产生cAMP，可激活cAMP依赖性PKA[14]。GCG通过PKA活化调节肝糖异生，在急性环境中，通过促进PKA磷酸化来刺激肝糖异生关键酶Pcx、Pck1、Fbp1和G6pc的基因表达，并激活这些糖异生过程中的关键酶系[15]，进而使血糖稳定在正常范围内，维持葡萄糖稳态平衡。
在本研究中，我们发现若要获得活率高形态好的小鼠原代肝细胞，在灌流阶段必须充分消化肝组织支持结构。实验初期，我们时常面临灌流针从门静脉掉出或者刺穿门静脉，导致灌流不充分并影响胶原酶消化肝组织支持结构。为了克服这个技术难题，我们使用留置针代替普通灌流针，避免了灌流针从门静脉掉出，能够使肝细胞支持结构充分消化。在小鼠原代肝细胞分离过程中，充分消化肝组织支持结构方能获得高活率的原代细胞，多次提取原代细胞的经验表明，灌流75 mL胶原酶液能够使肝组织支持结构充分消化，肝脏颜色变黄，组织彻底软化，在肝下叶看到小的清亮透明的部分并可能出现湿透的条纹布样纹理。当灌流胶原酶充分消化肝组织弹性纤维结构，分散液中可不加胶原酶消化液，对肝细胞活率并无明显影响。我们发现小鼠原代肝细胞分离洗涤过程中，与单纯洗涤液相比，在洗涤液中加入10%的胎牛血清可以更大程度满足细胞的营养需求，进一步维持细胞活性和细胞形态，分离后的原代肝细胞存活率达95%以上，细胞能够良好贴壁，贴壁后具有典型的肝细胞形态。研究表明，含有血清的培养条件更有利于细胞贴壁，细胞贴壁后我们比较了有无血清的培养条件下的细胞形态，发现无血清的培养环境更有利于维持小鼠原代肝细胞的形态和活性。
我们比较了小鼠原代肝细胞在有无GCG作用下的糖异生水平，发现小鼠原代肝细胞状态良好，能够对GCG做出有效响应。与DMSO对照组相比，在GCG作用下，细胞糖异生葡萄糖产出水平上升。此外，我们检测了糖代谢相关的关键酶系的mRNA相对表达量，结果表明，在GCG作用下，糖异生关键酶系基因的表达显著上升，糖酵解关键酶系基因的表达下降。进一步探究原代肝细胞对糖异生信号级联通路的应答情况，发现GCG作用下细胞cAMP含量显著增加，而在GCG处理的细胞中加入cAMP抑制剂，GCG上调葡萄糖产出水平的现象消失。为进一步观察细胞对糖异生信号级联通路的响应，我们还检测了细胞的PKA活性，结果表明GCG刺激的细胞PKA活性显著上调。糖代谢是机体为维持血糖稳定做出的各种调节和代偿性反应，由各器官协同应答，共同参与对机体血糖波动的调节。小鼠原代肝细胞能够在葡萄糖产出水平及信号级联通路水平在体外有效模拟哺乳动物肝脏的糖异生代谢，可用于分子机制研究以及药物代谢评价研究。
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