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杜江峰,吴 瑶,向 祥,汪 峰,张铃铛,李 骥
重庆大学附属三峡医院神经外科，重庆 404000
脑出血是常见多发的神经系统脑血管疾病，也是发病率、致残率和死亡率高的中风亚型，占全球所有中风的10%～20%，30 d内死亡率在30%～50%，即使是幸存者也经常会导致脑损伤和严重的神经功能障碍，给家庭和社会带来沉重的负担[1-2]。因此，了解脑出血诱导的脑损伤和神经损伤的潜在机制有利于减轻脑损伤并改善脑出血后的神经功能恢复。目前，研究证实了脑出血后的炎症反应参与了脑损伤[3]。微小RNA(miRNA)是一种小型、非编码的调节性RNA，与目标mRNA配对可抑制mRNA的翻译过程，或导致mRNA的降解，且在血清中稳定存在，在疾病的诊断和治疗中发挥重要作用。miR-331-3p是miR-331家族成员之一，对其的研究主要专注于癌症中，最近几年的研究发现，miR-331-3p在病理生理变化中异常表达，与炎症反应相关，具有潜在的神经保护作用[4]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族(NLRs)是一种主要的先天免疫传感器，调节炎症反应信号通路，近年来关于NLR在神经损伤方面的研究越来越多[5]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白6(NLRP6)是NLR家族的一员，参与炎症性疾病和宿主防御机制，其表达在许多生理和病理过程中受到严格调控[6]。在小鼠中的研究表明，miR-331-3p和NLRP6在脑出血的炎症反应中具有重要作用，但其在脑出血患者血清中的表达水平及与患者病情严重程度及神经损伤的关系目前尚未被研究[7]。因此，本研究检测脑出血患者血清中miR-331-3p和NLRP6的表达水平，初步探讨了其表达水平与病情严重程度及神经损伤的关系，旨在为临床制订新的治疗措施提供参考。
1.1一般资料 本研究选取2016年5月至2018年5月于本院神经外科诊治的92例脑出血患者作为观察组，其中男50例，女42例，年龄25～75岁，平均(50.26±11.56)岁。同时，选取同期体检的92例体检健康者为对照组，其中男44例，女48例，年龄30～78岁，平均(51.76±12.09)岁。纳入标准：(1)所有患者在发病后24 h内入院治疗，经颅脑CT检查确认出现出血灶；
(2)符合《中国脑血管病防治指南》[8]中的诊断标准；
(3)临床资料齐全。排除标准：(1)含潜在血管病变、凝血功能受损和肿瘤出血的患者；
(2)近1个月内发生感染的患者；
(3)头部外伤造成出血的患者；
(4)合并其他神经系统疾病的患者。本研究取得了本院伦理委员会的批准，并获得了对照组和患者本人及亲属的书面知情同意。
1.2方法
1.2.1标本采集与保存 采集观察组和对照组清晨空腹状态下的静脉血5 mL，在4 ℃条件下3 000×g离心10 min后，从血液中分离出血清后分装到无菌的离心管内，在-80 ℃保存至测定。
1.2.2实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测miR-331-3p和NLRP6的表达水平 根据试剂盒的说明书，使用TRIzol(货号：10296028，购于赛默飞世尔科技有限公司)从观察组和对照组的血清中提取总RNA。然后取0.5～1.0 μL的RNA使用PrimeScriptM RT Reagent Kit(货号：RR037A，购于日本TaKaRa公司)根据试剂盒说明书进行反转录反应，获得cDNA保存于-20 ℃备用。以cDNA为模板，使用TB Green©Premix Ex Taq Ⅱ Kit(货号：RR820A，购于购于日本TaKaRa公司)在ABI7500荧光定量系统上进行实时RT-PCR分析。定量引物使用Primer5.0软件设计，分别以U6和GAPDH作miR-331-3p和NLRP6的内参基因，引物序列见表1，引物干粉由上海生工生物公司合成。采用2-ΔΔct法分析各组表达水平，计算步骤为：(1)计算对照组6个复孔的miR-331-3p或NLRP6 ct的平均值，ct miR-331-3p或NLRP6对照组=ct对照组-miR-331-3p或NLRP6 ct的平均值，ct miR-331-3p或NLRP6观察组=ct观察组-miR-331-3p或NLRP6 ct的平均值；
(2)同样的方法计算出ct内参对照组和ct内参观察组；
(3)计算ct miR-331-3p或NLRP6对照组=ct miR-331-3p或NLRP6对照组-ct内参对照组，ct miR-331-3p或NLRP6观察组=ct miR-331-3p或NLRP6观察组-ct内参观察组；
(4)计算2-ΔΔct，即各组miR-331-3p或NLRP6的相对表达水平。
表1 RT-RCR引物序列
1.2.3脑出血严重程度及神经损伤程度评定 根据入院时头颅CT检测结果，采用多田氏公式(ABC/2)法计算血肿体积评估病情严重程度，A：最大出血层面血肿的最长径，B：最大出血层面血肿的宽，C：血肿层面之间的厚度。患者可分为大血肿组(>25 mL)，中血肿(11～25 mL)，小血肿组(<11 mL)。根据美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分评定脑出血患者的神经功能受损程度，包括意识清醒程度和肌力等级等项目。NIHSS评分总分为42分，患者可分为轻型患者组(1～4分)，中型患者组(>4～15分)，重型患者组(>15分)[9]。
2.1两组血清miR-331-3p和NLRP6表达水平的差异 RT-PCR结果显示，观察组中miR-331-3p表达水平与对照组相比降低，而观察组中NLRP6表达水平与对照组相比升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。
表2 两组血清miR-331-3p和NLRP6表达水平的差异
2.2不同血肿体积患者中血清miR-331-3p和NLRP6表达水平的差异 根据血肿体积大小将92例患者划分为21例大血肿组，33例中血肿组和38组小血肿组。结果如表3所示，miR-331-3p表达水平在大血肿组患者血清中低于中、小血肿组，在中血肿组患者血清中低于小血肿组，差异有统计学意义(P<0.05)，NLRP6表达水平在大血肿组患者血清中高于中、小血肿组，在中血肿组患者血清中高于小血肿组，差异有统计学意义(P<0.05)。
表3 不同血肿体积患者中血清miR-331-3p和NLRP6表达水平的差异
2.3不同神经损伤患者中血清miR-331-3p和NLRP6表达水平的差异 根据NIHSS评分将92例患者划分为33例轻型患者组、40例中型患者组和19例重型患者组。结果如表4所示，miR-331-3p表达水平在重型患者组血清中低于轻、中型患者组，在中型患者组血清中低于轻型患者组，差异有统计学意义(P<0.05)，NLRP6表达水平在重型患者组血清中高于轻、中型患者组，在中型患者组血清中高于轻型患者组，差异有统计学意义(P<0.05)。
表4 不同神经损伤患者中血清miR-331-3p和NLRP6表达水平的差异
2.4观察组患者血清miR-331-3p、NLRP6表达水平与血肿体积和NIHSS评分的相关性 Pearson相关性分析结果显示，脑出血患者的血清miR-331-3p表达水平与血肿体积和NIHSS评分呈负相关(r=-0.539，P<0.05；
r=-0.597，P<0.05)，血清NLRP6表达水平与血肿体积和NIHSS评分呈正相关(r=0.738，P<0.05；
r=0.705，P<0.05)，见图1。
注：A为血清miR-331-3p与NLRP6评分的相关性；
B为血清miR-331-3p对血肿体积的相关性；
C为血清NLRP6与HIHSS评分的相关性；
D为血清NLRP6与血肿体积的相关性。图1 观察组患者血清miR-331-3p、NLRP6表达水平与血肿体积和NIHSS评分的相关性分析
2.5观察组患者血清miR-331-3p与NLRP6表达水平的相关性 Pearson相关性分析结果脑出血患者血清中miR-331-3p表达水平与NLRP6表达水平呈负相关(r=-0.483，P<0.05)，见图2。
图2 观察组患者血清miR-331-3p与NLRP6表达水平的相关性分析
随着人口的老龄化，脑出血的发病率也在逐渐升高，是社会上面临的重大的公共健康问题[1]。脑出血后的水肿、炎症反应等共同引起继发性脑损伤，细胞凋亡，最终导致神经功能受损，而目前对于脑出血这一疾病的临床治疗方式仍没有突破性进展[9-10]。从分子角度探索脑出血引起的神经炎症损伤的机制，能够为寻找临床治疗脑出血后遗症的有效靶点提供理论依据。
miRNAs对脑出血的影响是近年来的研究热点，大量结果证实了miRNAs广泛参与脑出血后的病理生理机制，在脑出血后继发性脑损伤的发生过程中发挥积极或消极的作用。例如，miR-223在脑出血疾病中通过下调NLRP3，抑制炎症反应，从而改善神经功能[11]。miR-331-3p是miR-331家族的一员，位于12q22n染色体上，越来越多的研究报道，miR-331-3p在疾病中发挥重要作用。朱金源等[12]在急性肺损伤中发现miR-331-3p表达水平下降，并且可通过调控CCR1的表达水平参与该疾病的发生发展过程。LIU等[4]在阿尔茨海默病患者的血清中发现miR-331-3p表达降低，并与患者的简易精神状态检查量表评分和促炎细胞因子水平相关，提示miR-331-3p具有潜在的神经保护作用。NIE等[7]在小鼠中的实验结果首次提示，miR-331-3p可能在脑出血后的炎症反应中发挥作用。本研究在脑出血患者的血清中同样发现miR-331-3p的表达水平下降，说明血清miR-331-3p的表达水平在脑出血的发生过程中具有重要作用。血肿体积和NIHSS评分与患者的病情和神经功能密切相关，本研究结果显示，血清miR-331-3p在不同血肿体积的患者和不同NIHSS评分的患者中的表达水平存在差异，大血肿患者miR-331-3p表达水平低于中、小血肿患者，重型患者miR-331-3p表达水平低于中、轻型患者，进一步分析显示血清miR-331-3p表达水平与脑出血患者的血肿体积和NIHSS评分呈负相关，表明血清miR-331-3p的水平与脑出血的严重程度和神经损伤程度之间存在密切关联。
NLRP6是报道的第一个能抑制先天免疫反应的NLRP家族成员，之前有研究证实其在脑缺血/再灌注损伤后表达上调，具有炎症小体依赖性促炎作用，可作为炎症性疾病潜在的治疗靶点[13]。XIAO等[14]发现NLRP6炎性小体可能通过激活小胶质细胞IL-1β和IL-18参与脑出血后的炎症反应，敲低NLRP6可减轻脑出血后的脑损伤、缓解炎症并抑制自噬。NLRP6的研究大都集中在动物实验中，本研究检测了脑出血患者的血清中NLRP6的表达水平，与对照组相比表达水平增加，说明NLRP6表达水平与脑出血的发生有关。不同血肿体积的患者和不同NIHSS评分的患者中NLRP6的表达水平存在差异，大血肿患者NLRP6表达水平高于中、小血肿患者，重型患者NLRP6表达水平高于中、轻型患者，且血清NLRP6表达水平与脑出血患者的血肿体积和NIHSS评分呈正相关，表明NLRP6在脑出血后的脑损伤和神经功能障碍中具有重要作用，可能参与脑损伤和神经功能障碍发生过程。
miR-331-3p涉及多个神经生物学过程的信号通路，并且此前的研究提出miR-331-3p下调可增加NLRP6表达水平，减轻炎症反应，促进脑出血后小鼠神经功能恢复[7,15]。本研究分析结果与之相似，脑出血患者血清中miR-331-3p与NLRP6表达水平呈负相关，说明两者共同影响了脑出血患者的病情和神经受损程度，可作为临床改善脑出血后损伤的潜在治疗靶点。
综上所述，脑出血患者血清中miR-331-3p表达水平降低，NLRP6表达水平升高，随着病情和神经受损程度的加重，miR-331-3p表达水平逐渐降低，NLRP6表达水平逐渐升高，两者表达水平与脑出血患者的病情严重程度和神经受损程度相关，共同参与脑出血的发展过程，可能作为脑出血临床治疗的靶点。
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