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陆 萌，石学魁，王 妍
(牡丹江医学院病原生物学教研室，黑龙江 牡丹江 157011)
氧化应激是由于机体内活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生过多，导致氧化物质与清除氧自由基的抗氧化物质失衡，氧自由基和相关代谢产物过量聚集，进而引起组织细胞氧化损伤甚至死亡，是导致心血管疾病、癌症、神经退行性疾病等的主要原因之一[1-2]。增强机体抗氧化能力可有效提高机体抗病能力，具有多重保健作用[3]。
羟基红花黄色素A (hydroxysafflor yellow A， HSYA)是从中药红花中分离获得的含量较高的最主要活性成分，可清除自由基、抑制脂质过氧化等，具有抗炎抗氧化作用。研究发现，HSYA可以提高神经细胞内谷胱甘肽(glutathione，GSH)含量、增加超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、减少细胞色素C氧化酶(cytochrome C，CytC)的释放、降低丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量，从而拮抗谷氨酸介导的氧化性神经毒性[4]。然而，鉴于中药成分复杂，虽然目前HSYA抗氧化较明确，但其作用机制研究并不透彻。网络药理学可以通过构建 “疾病-药物 ”网络进行分析，不局限于单一的成分、靶点和疾病，来阐明中药 “多组分-多靶点-多通路 ”的特点[5-6]。因此，本研究利用网络药理学方法，深入探讨HSYA抗氧化的成分-多靶点-多途径整体调节的作用机制，为后续基础研究及临床应用提供一定的理论依据。
1.1 HSYA相关作用靶点的获取通过 PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[7]检索HSYA 的 2D 结构，保存为SDF格式文件；
将SDF文件上传至 SwissTargetPrediction 数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)[8]，获得HSYA相应的潜在作用靶点，通过Uniprot数据库对靶点信息进行标准化。
1.2 抗氧化作用相关靶点的获取通过GeneCards人类基因数据库(https://www.genecards.org/.Version 5.0)[9]、Online Mendelian Inheritance in Man 在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM，https://omim.org/，Updated September 13.2021)[10]，以“anti-oxidation”“anti oxidation”为关键词，检索与抗氧化作用相关的潜在靶点。
1.3 HSYA抗氧化作用靶点的筛选把检索到的HSYA潜在作用靶点与抗氧化作用相关靶点导入在线平台Version 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)[11]，两个靶点集合取交集得到两者间共同靶点，即为HSYA抗氧化作用的候选靶点，
1.4 HSYA抗氧化作用靶点网络的构建将HSYA与抗氧化靶点信息导入 Cytoscape 3.8.0 软件，构建HSYA-靶点网络。
1.5 蛋白-蛋白相互作用网络构建及分析将HSYA 抗氧化作用靶点信息导入 STRING 数据库(http://string-db.org/，Version 11.0)，构建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络[12]，选择“Multiple protein”，设置物种为“Homo sapiens”，其余参数保持默认设置。下载靶点相互作用关系TSV文件，导入Cytoscape 3.8.0 软件，利用该软件中插件Network Analyzer 对网络参数进行分析。
1.6 靶点GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析将筛选出的 HSYA 抗氧化作用靶点输入 R软件(version 3.6.1)，利用 R 软件的clusterProfiler包[13]进行基因本体论(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，设置pvaluecutoff=0.05，qvaluecutoff=0.05。
1.7 “HSYA化合物-靶点-通路 ”网络构建利用Cytoscape 3.8.0软件构建 HSYA 化合物-靶点-通路网络图，节点代表HSYA、作用靶点或富集的信号通路，边代表HSYA-作用靶点、作用靶点-信号通路相连接。
1.8 分子对接验证从网站http://www.chemspider.com/获取 HSYA 分子 3D 结构 mol 格式，由Open Babel GUI(version 2.4.1 )软件转换为 mol2 格式[14]。从 RCSB PDB 数据库[15](https://www.rcsb.org/)下载对应靶点基因的 3D 分子结构 PDB 格式文件。利用 LeDock 软件(http://www.lephar.com)进行分子对接(molecular docking)[16]，通过PyMol 1.7.2.1 软件(http://www.pymol.org)进行分子对接的可视化分析。
2.1 HSYA相关作用靶点筛选从 PubChem 数据库中得到的 HSYA 的 2D 结构 SDF 文件上传至SwissTargetPrediction网站,获取的潜在靶点经 Uniprot 数据库进行校正,得到经验证的靶点 100 个作为 HSYA 的相关作用靶点。
2.2 抗氧化相关靶点筛选检索 GeneCards 数据库，根据中位数筛选出 Relevance score>10.23的抗氧化靶点 502 个；
检索 OMIM 数据库得到抗氧化靶 点19个。将2个数据库的靶点整合，去除重复靶点后最终获得518个与抗氧化相关的靶点。
2.3 HSYA抗氧化靶点的筛选将筛选出的HSYA相关作用靶点与 GeneCards、OMIM 数据库筛选出的抗氧化的靶点取交集，得到共同靶点31个(图1)，即为 HSYA 抗氧化作用的潜在靶点.靶点信息详见表1。
图1 HSYA抗氧化作用靶点韦恩图
表1 HSYA抗氧化作用潜在靶点
2.4 HSYA抗氧化作用靶点的网络利用Cytoscape 3.8.0 软件构建 HSYA-靶点可视化相互关系网络(图2)。该网络中红色六边形节点代表HSYA，绿色椭圆形节点代表HSYA的潜在抗氧化作用靶点，边代表相互关系。该网络图表明，HSYA可通过作用于多个靶点发挥抗氧化作用。
图2 HSYA化合物-靶点可视化网络图
2.5 HSYA抗氧化的蛋白相互作用网络构建将HSYA抗氧化作用靶点信息导入STRING数据库，获得这些靶点相互作用关系，然后通过Cytoscape3.8.0软件构建PPI网络(图3)。图中每一个节点(node)代表一个HSYA抗氧化作用靶点，边(edge)代表各靶点之间的相互关系。节点颜色和大小反映了靶点的连接度(degree)，颜色由绿逐渐变红，越接近红色、节点越大表示该靶点的度值越大，说明该靶点在网络中的作用越重要。该网络中度值排名前10位的靶点依次为PTGS2(21)、EGFR(20)、JUN(20)、STAT3(19)、MTOR(18)、HSP90AA1(18)、KDR(18)、IL1B(18)、BCL2L1(16)、FN1(15)。
图3 HSYA抗氧化作用靶点的蛋白互作网络图
2.6 GO富集分析和KEGG通路富集分析结果将HSYA抗氧化靶点进行GO富集分析，结果显示，全部 31 个抗氧化靶点共富集到 763 个相关 GO 条目中，其中包括肽-丝氨酸磷酸化、肽-丝氨酸修正、正调控活性氧代谢过程、调控活性氧代谢过程、有机磷反应、神经炎症反应、嘌呤化合物反应、正调控一氧化氮生物合成过程、正调控一氧化氮代谢过程、急性时相反应、调控活性氧生物合成过程、活性氧代谢过程等，富集排名前15的条目见图4。
图4 GO富集分析气泡图
对31个HSYA抗氧化靶点进行 KEGG 通路富集分析，这些靶点可富集到104条信号通路中，其中排名前 15 的通路见图 5。主要包括EGFR酪氨酸激酶抑制和耐药信号通路、前列腺癌相关通路、糖尿病并发症相关的 AGE-RAGE 信号通路、NOD 样受体信号通路、胰腺癌相关通路、PI3K-Akt 信号通路、IL-17 信号通路、人巨细胞病毒感染相关通路、JAK-STAT 信号通路、C型凝集素受体信号通路、Th17细胞分化相关通路、HIF-1信号通路、卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染通路、麻疹相关通路、EerB信号通路。结果表明，HSYA可以通过多条通路发挥抗氧化作用。
图5 KEGG通路富集分析气泡图
2.7 HSYA化合物-靶点-通路网络构建将HSYA、31个靶点基因和KEGGPathways分析的前20条通路，构建HSYA化合物-靶点-通路网络图，见图6。该网络中V字形节点代表信号通路，菱形节点代表HSYA化合物，椭圆形节点代表靶点。网络中节点颜色由绿到红、由小到大表示节点的度值逐渐变大。PIK3CA、MTOR、IKBKB、STAT3、EGFR、JUN等靶点节点较大，说明其可能成为HSYA抗氧化作用的靶点。PI3K-Akt信号通路、NOD样受体信号通路、JAK-STAT信号通路、EGFR酪氨酸激酶 抑制和耐药通路、HIF-1信号通路、Th17细胞分化相关通路、IL-17信号通路、EerB信号通路等是HSYA抗氧化作用的潜在通路。参与PI3K-Akt信号通路、NOD样受体信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制和耐药通路、JAK-STAT信号通路的靶点有10、8、7、7个；
其中PI3K-Akt信号通路在前20条信号通路中存在靶点数量最高，因此该通路可作为HSYA抗氧化作用有效的通路之一。而且，PIK3CA、MTOR、IKBKB、STAT3、EGFR、JUN等靶点在前20的信号通路中涉及6条以上的信号通路，由该网络图说明，HSYA通过多靶点、多信号通路协同调控而发挥抗氧化作用。
图6 HSYA化合物-靶点-通路网络图
2.8 分子对接验证根据PPI网络和化合物-靶点-通路网络，选取6个靶点(PIK3CA、MTOR、IKBKB、STAT3、EGFR、JUN)与HSYA进行分子对接，结果如表2所示，结合自由能均小于-6 kcal/mol，表明HSYA与上述靶点具有较强的结合力。利用PyMol软件对分子对接结果进行可视化，结果见图7。通过分子对接进一步验证了网络药理学对HSYA抗氧化作用靶点预测的可靠性。
图7 分子对接模式图
表2 HSYA与对应作用靶点间的分子对接
本研究应用网络药理学方法.从成分、蛋白、通路多层次分析了HSYA抗氧化作用机制，筛选出HSYA抗氧化作用靶点，探索了HSYA化合物、靶点蛋白、信号通路之间的网络特征。结果显示，筛选出31个关键靶点与抗氧化作用相关，连接度较高的前10个靶点有PTGS2、EGFR、JUN、STAT3、MTOR、HSP90AA1、KDR、IL1B、BCL2L1、FN1等；
其中，PIK3CA、MTOR、IKBKB、STAT3、EGFR、JUN等靶点参与多条信号通路。并且通过分子对接验证了HSYA与相关靶点的相互作用，证明了网络药理学预测的可靠性。
GO富集显示，31 个抗氧化作用靶点共富集到763个相关GO条目中，提示肽-丝氨酸磷酸化、正调控活性氧代谢过程、调控活性氧代谢过程、神经炎症反应、正调控一氧化氮生物合成过程、正调控一氧化氮代谢过程、急性时相反应、调控活性氧生物合成过程、活性氧代谢过程等与抗氧化作用相关。
在涉及的抗氧化通路方面，PI3K-Akt信号通路、NOD样受体信号通路、JAK-STAT信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制和耐药通路、HIF-1信号通路、Th17细胞分化相关通路、IL-17信号通路、EerB信号通路等的节点度值较高，有多个靶点参与。有学者研究发现，H2S可能通过PI3K/Akt依赖性激活Nrf 2 信号通路对吸烟大鼠左心室重构产生抗氧化作用[17]；
二苯乙烯类化合物能通过PI3K/Akt信号通路降低细胞内活性氧(ROS)，对大鼠皮质神经元起到抗氧化作用[18]。体外实验证实.HSYA亦可以通过调控PI3K/Akt/GSK3β信号通路保护大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤[19]。这些研究说明PI3K/Akt信号通路与抗氧化作用密切相关。EGFR酪氨酸激酶抑制和耐药通路上存在的EGFR被EGF识别结合，能够激活酪氨酸激酶区，导致EGF磷酸化，促进细胞的分裂增殖及正常细胞的恶性突变，对调节细胞凋亡、增殖、分化、迁移和细胞周期发挥十分重要的作用[20]。与先前研究结果一致，HSYA可能通过这些通路发挥抗氧化作用。通过成分-靶点-通路网络分析，发现每个信号通路富集有多个靶点，每个靶点参与多条信号通路。由此说明，HSYA通过多靶点、多信号通路协同调控而发挥抗氧化作用。
综上所述，本研究应用网络药理学方法，从作用机制方面入手，探讨HSYA抗氧化作用的关键作用靶点、生物学功能以及相关的信号通路，阐明了HSYA通过多靶点、多途径的协同效应发挥抗氧化作用。由于网络药理学数据库资源信息的局限性，预测结果尚不能完全证明其正确性，在此基础上，后续将进行动物在体实验、体外细胞实验对作用机制予以验证，以期为拓展其临床应用提供参考。
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