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刘静，牛秀梅，王美美，胡雨晴，张瑞，高惠颖，吕长鑫*
（1.渤海大学食品科学与工程学院，辽宁省食品安全重点实验室，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁 锦州 121013；
2.锦州市检验检测认证中心，辽宁 锦州 121013）
紫薯（purple sweet potato）又名黑薯、紫红薯[1]，富含花青素、多糖和矿物质等多种营养成分[2-3]。桑葚（mulberry）又名桑果，富含黄酮醇、花青素等活性物质，适合用于开发具有保健功能的产品[4-5]。随着大众对养生的关注度越来越高，保健类口服液逐渐成为热销产品，市场上出现的保健口服液多以美白、抗衰老、抗疲劳等功效迎合消费者需求。目前，尚未见有紫薯桑葚复合口服液的研究，因此以紫薯和桑葚为原料进行紫薯桑葚口服液的研究，具有很大的开发前景[6]。
目前针对复合口服液在消化过程中活性成分变化及抗氧化活性变化规律的研究较少，体外模拟消化具有成本低、易于操控等优点[7-8]。故本试验以紫薯为原料进行提取浓缩制得紫薯提取液，用桑葚汁进行复合调配，制备一款具有较高生物活性成分的复合口服液，并采用体外模拟胃肠消化法，以总酚、黄酮、花色苷含量为指标评价此款复合口服液在消化过程中的活性物质变化规律以及抗氧化能力的变化，为综合评价紫薯桑葚复合口服液的营养价值提供参考。
1.1 材料与试剂
紫薯：辽宁省锦州市春利农业发展科技有限公司；
桑葚：辽宁省葫芦岛市南票区虹螺岘镇虹南村小南沟屯；
白砂糖、柠檬酸（食品级）：市售；
猪胆盐、胃蛋白酶（250 000 U/g）、胰蛋白酶（10 000 U/g）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2"-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]、1，1- 二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（均为分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；
α-淀粉酶（50 000 U/g）、糖化酶（50 000 U/g）（均为食品级）：江苏锐康莱科技有限公司。
1.2 仪器与设备
紫外可见分光光度计（UV-2700）：日本岛津仪器有限公司；
冷冻离心机（5804R）：德国艾本德公司；
冷冻水浴恒温振荡器（SHA-2）：金坛市瑞华仪器有限公司。
1.3 工艺流程
1.4 方法
1.4.1 操作要点
紫薯提取液制备：将紫薯切片烘干粉碎后过60目筛备用。称取10 g紫薯粉加入0.1%α-淀粉酶、0.15%糖化酶、300 mL 70%（体积分数）乙醇溶液，振荡混合均匀。200 W超声波辅助提取40 min、85℃灭酶5 min、50℃真空浓缩、定容至100 mL，即得紫薯提取液。
桑葚汁制备：桑葚解冻、打浆（6 000 r/min，2 min）、酶解（果胶酶0.06%、纤维素酶0.09%，48℃搅拌酶解120 min），粗滤两次后离心得桑葚原汁。
紫薯桑葚复合口服液制备：将紫薯提取液和桑葚汁按照一定的质量比混合，加入白砂糖和柠檬酸进行调配，灌装杀菌即得紫薯桑葚复合口服液。
1.4.2 紫薯桑葚复合口服液配方优化试验
1.4.2.1 单因素试验
以紫薯提取液与桑葚汁质量比3∶4、柠檬酸0.02%、白砂糖4%为固定参数，考察紫薯提取液与桑葚汁质量比（2∶5、3∶4、4∶3、5∶2、6∶1）、柠檬酸添加量（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%）、白砂糖添加量（2%、3%、4%、5%、6%）对紫薯桑葚复合口服液感官评分的影响。
1.4.2.2 正交试验设计
根据单因素试验结果，设计L9（34）正交试验优化紫薯桑葚复合口服液配方。正交试验因素水平见表1。
表1 正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal test
1.4.2.3 感官评价
参考GB 7101—2015《食品安全国家标准饮料》感官要求规定，以100为满分，各项占比为色泽∶气味∶口感∶组织状态=2∶3∶3∶2，依据紫薯桑葚复合口服液的特点制定出产品感官评价标准，如表2所示。
表2 紫薯桑葚复合口服液评价标准Table 2 Standard for evaluation of purple sweet potato and mulberry compound oral liquid
1.4.3 体外模拟胃肠消化
体外模拟胃肠消化参考Estévez-Santiago等[9]的方法，略作修改。
模拟胃消化：取1mL样品加入19mL生理盐水，用1 mol/L的HCl溶液调节pH值至2.0，将样品分为3组。
式中：N样品稀释倍数；
M为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷摩尔质量，449.38 g/mol；
ε为消光系数，26 900 L/（mol·cm）；
L 为光程，1 cm。
1.4.4.2 总酚含量测定
参考王储炎等[11]的方法，配制0.1 mg/mL没食子酸溶液，分别取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，加 0.5 mL 福林酚试剂，1 min后加1.5 mL 15%Na2CO3溶液，蒸馏水定容，室温避光1 h，于765 nm处测定吸光度，绘制没食子酸标准曲线，方程为y=67.086x+0.015，R2=0.999。准确量取0.1mL口服液代替没食子酸溶液，按上述步骤测定，根据没食子酸标准曲线方程计算总酚含量，结果以每毫升口服液所含没食子酸当量（mg GAE/mL）表示。模拟胃液消化组：加4mL胃液（0.2g胃蛋白酶溶于10mL 0.01 mol/L HCl溶液）；
胃酸对照组：加4 mL 0.01 mol/L的盐酸；
空白组：加4 mL生理盐水。
模拟肠消化：模拟胃消化之后，将样品用1 mol/L的NaHCO3溶液调节pH值至7.0，将样品分为2组。肠液消化组：加入4 mL胰蛋白酶-胆汁混合液（1.9 g猪胆盐和0.3 g胰蛋白酶溶于60 mL 0.1 mol/L NaHCO3缓冲溶液）；
空白组以等量的0.1 mol/L的NaHCO3缓冲液代替。
将上述各组待测溶液于37℃恒温水浴振荡2 h，分别消化 0、0.5、1.0、1.5、2.0 h，取出部分样品经8 000 r/min离心10 min，取上清液用于指标测定。
1.4.4 体外模拟消化过程中活性成分测定
1.4.4.1 花色苷含量测定
采用pH示差法[10]，取1 mL口服液样品，各加9 mL pH1.0和pH4.5的缓冲液，室温避光静置1 h，以1 mL蒸馏水代替口服液样品，为空白对照，分别于510 nm和700 nm 处测吸光度（A510nm、A700nm），紫薯桑葚复合口服液中花色苷含量按式（2）进行计算。
1.4.4.3 黄酮含量测定
参考Somboonpanyakul等[12]的方法，配制0.2 mg/mL芦丁溶液，分别取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，每隔5 min依次加1.0mL5%NaNO2、1.0 mL 10%Al（NO3）3和10 mL 4%NaOH，60%乙醇定容，静置15 min，于510 nm处测吸光度，绘制芦丁标准曲线方程为y=7.148 6x+0.005，R2=0.999 9。准确量取1 mL口服液代替芦丁溶液，按上述步骤测定，根据芦丁标准曲线方程计算黄酮含量，结果以每毫升口服液所含芦丁当量（mg RE/mL）表示。
1.4.5 体外模拟消化过程中抗氧化活性测定
1.4.5.1 DPPH自由基清除率测定
根据Pezeshk等[13]的方法，取0.1 mL口服液样品与3.9 mL 0.1 mg/mL DPPH溶液混合，室温避光静置30 min，于517 nm处测吸光度记为A1；
以无水乙醇代替口服液样品测吸光度记为A0；
以无水乙醇代替DPPH溶液测吸光度记为A2，DPPH自由基清除率计算公式如下。
1.4.5.2 ABTS+自由基清除率测定
参考Kiselova等[14]的方法，制备ABTS工作液。取50 μL口服液样品与3.5mLABTS工作液混匀，在734nm处测定吸光度记为A1；
无水乙醇代替口服液样品测吸光度记为A0；
用缓冲液代替ABTS溶液测定吸光度记为A2，ABTS+自由基清除率计算公式如下。
1.4.5.3 羟自由基清除率测定
根据Li等[15]的方法并进行改进，取0.1 mL口服液样品，依次加 2 mL 6 mmol/L FeSO4、6 mmol/L H2O2和6 mmol/L水杨酸，37℃水浴30 min，于510 nm测吸光值记为A1；
用蒸馏水代替口服液样品测定吸光度记为A0；
蒸馏水代替H2O2溶液测定吸光度记为A2，羟自由基清除率计算公式如下。
1.5 数据处理
采用SPSS 23.0软件进行显著性分析，p＜0.05表示差异显著，应用Origin 9.0及Excel绘制图形。
2.1 单因素试验结果
2.1.1 紫薯提取液与桑葚汁质量比对感官评分的影响
当紫薯提取液和桑葚汁质量比为4∶3时感官评分最高，且风味协调，颜色呈亮紫黑色；
当质量比小于4∶3时，口服液桑葚味突出，呈现暗紫色且沉淀较明显；
当质量比大于4∶3时，味道偏清淡且具有明显的熟后“番薯味”，不易被大众接受。因此紫薯提取液与桑葚汁质量比选择4∶3，此时风味更协调。
2.1.2 白砂糖添加量对感官评分的影响
当白砂糖添加量为2%～4%时，感官评分随白砂糖添加量的增加而升高，此时紫薯提取液的苦涩味逐渐减弱；
当白砂糖添加量高于4%时，感官评分下降，过量添加白砂糖使得紫薯桑葚复合口服液口感偏甜，不易被大众接受，同时也掩盖了紫薯和桑葚特有风味。综合考虑，选择白砂糖添加量4%，此时制得口服液甜度适宜。
2.1.3 柠檬酸添加量对感官评分的影响
当柠檬酸添加量高于0.03%时，感官评分迅速下降，这是因为过大的酸味使得紫薯桑葚复合口服液原有风味遭到破坏，因此选择柠檬酸添加量0.03%，此时酸度最适宜。
2.2 正交试验结果
在单因素试验基础上进行L9（34）正交试验，试验结果见表3，方差分析结果见表4。
表3 正交试验结果Table 3 Results of the orthogonal experiment
表4 正交试验方差分析结果Table 4 Results of variance analysis of orthogonal experiment
由表3试验结果可知最佳配方为A2B2C1，由表4可知，紫薯提取液与桑葚汁质量比、白砂糖添加量对口服液感官品质影响较为显著（p＜0.05）。对正交试验优化的最佳配方进行验证试验，感官评分为83.42。因此，可确定该产品最佳配方：紫薯提取液与桑葚汁以质量比4∶3复合、添加量95.98%，白砂糖添加量4%，柠檬酸添加量0.02%，制得的紫薯桑葚复合口服液口感适宜、风味协调。
2.3 体外模拟消化过程中活性物质变化
2.3.1 总酚含量的变化
模拟消化过程中总酚含量变化见图1。
图1 模拟消化过程中总酚含量变化Fig.1 Changes in total phenol content during simulated digestion
如图1所示，紫薯桑葚复合口服液在模拟胃液消化 0.5 h时，总酚含量显著上升（p＜0.05），0.5 h～1.0 h显著下降（p＜0.05）后趋于稳定，相反，胃酸和胃空白对照组的总酚含量在0.5 h时显著下降（p＜0.05）。并且在模拟胃消化2.0 h内胃液消化组＞胃酸对照组＞胃空白对照组，这说明胃蛋白酶和酸性条件对紫薯桑葚复合口服液中多酚的释放有促进作用，这可能是胃蛋白酶能够分解大分子蛋白质，使得某些与蛋白质结合的酚类物质得以释放，此外酸性条件下酚类物质易发生水解，使得酚含量增加[16-17]。在模拟肠消化过程中，0 h时总酚含量与模拟胃消化相比显著下降，可能是某些酸性酚类化合物在中性环境下发生降解生成了其他物质[18]；
0～1.0 h 显著上升（p＜0.05），可能是由于与多糖以酯键形式结合形成糖苷的多酚分子在酶的作用下水解释放，导致整体酚羟基含量有所上升[19]。
2.3.2 黄酮含量的变化
模拟消化过程中黄酮含量变化见图2。
图2 模拟消化过程中黄酮含量变化Fig.2 Changes in flavonoid content during simulated digestion
如图2所示，模拟胃液消化0～0.5 h黄酮含量显著上升（p＜0.05），0.5 h～2.0 h趋于稳定；
胃酸对照组在 1.5 h达到最大值7.74 mg RE/mL，是初始值的1.06倍；
胃空白对照组无显著变化。这表明胃蛋白酶和胃酸对紫薯桑葚复合口服液黄酮释放量均起促进作用。模拟肠消化过程中，肠液消化组与肠空白对照组的黄酮变化规律基本一致。0～0.5 h内黄酮含量降低，可能是因为黄酮类物质在环境变化情况下不稳定所致；
0.5 h～1.0 h黄酮含量显著提高（p＜0.05），推测可能是某些复合的黄酮类大分子受环境、胰蛋白酶等影响，分解为黄酮小分子[20]；
1.0 h～2.0 h 整体上显著下降（p＜0.05）可能是损失量大于降解释放量。
2.3.3 花色苷含量的变化
模拟消化过程中花色苷含量变化见图3。
图3 模拟消化过程中花色苷含量变化Fig.3 Changes in anthocyanin content during simulated digestion
如图3所示，胃液消化组的花色苷含量在1.5 h时显著上升（p＜0.05），1.5 h～2.0 h 有所下降，即花色苷含量随着胃液消化的进行先上升后下降，这与Huang等[21]和Tagliazucchi等[22]的研究结果相似；
胃酸对照组和胃空白对照组变化不显著（p＞0.05），可能由于酸性环境下胃蛋白酶水解蛋白质，促进花色苷释放，这与刘翼翔等[23]研究蓝莓花色苷体外模拟消化实验结果基本一致。在模拟肠消化过程中，模拟肠消化2.0 h时肠液消化组花色苷含量下降程度比肠空白对照组更显著（p＜0.05），这表明肠消化环境对花色苷含量有显著影响，因为中性条件下花色苷不稳定易发生降解。
2.4 模拟胃肠消化过程中抗氧化活性变化
2.4.1 DPPH自由基清除率
模拟消化过程中DPPH自由基清除率变化见图4。
图4 模拟消化过程中DPPH自由基清除率变化Fig.4 Changes in DPPH radical scavenging capacity during simulated digestion
如图4所示，模拟胃消化2 h时，胃液消化组、胃酸对照组和胃空白对照组DPPH自由基清除率均显著上升（p＜0.05），且时胃液消化组＞胃酸对照组＞胃空白对照组，这表明胃蛋白酶以及酸性条件协同促进了DPPH自由基清除能力的提升。结合图2～图4可知，紫薯桑葚复合口服液在模拟消化过程中黄酮和花色苷含量与DPPH自由基清除能力变化规律相似，表明模拟胃消化过程中黄酮和花色苷对DPPH自由基清除能力起重要作用。肠液消化组中DPPH自由基清除率在模拟肠消化2 h时显著上升（p＜0.05），肠空白对照组显著下降（p＜0.05），这说明胰酶对DPPH自由基清除能力有一定的影响。
2.4.2 ABTS+自由基清除率
模拟消化过程中ABTS+自由基清除率变化见图5。
图5 模拟消化过程中ABTS+自由基清除率变化Fig.5 Changes in ABTS+radical scavenging capacity during simulated digestion
如图5所示，模拟胃液消化2 h时，ABTS+自由基清除率在胃液以及胃酸作用下均显著上升（p＜0.05），胃空白对照组无显著变化（p＜0.05），胃液消化组和胃酸对照组的ABTS+自由基清除率分别上升到86.87%和84.15%，这表明胃蛋白酶和酸性条件均能够增强ABTS+自由基清除率。模拟肠消化阶段，与0h相比，肠液消化组ABTS+自由基清除率在0.5h～2.0h显著上升（p＜0.05）；
肠空白对照组 2 h时无显著差异（p＞0.05），这表明胰蛋白酶和胆汁可增强ABTS+自由基清除能力。
2.4.3 羟自由基清除率
模拟消化过程中羟自由基清除率变化见图6。
图6 模拟消化过程中羟自由基清除率变化Fig.6 Changes in hydroxyl radical scavenging capacity during simulated digestion
如图6所示，胃液消化组在1.0 h时，羟自由基清除能力显著上升（p＜0.05）后逐渐趋于稳定，胃酸对照组和胃空白对照组在0.5 h内显著下降（p＜0.05）。羟自由基清除能力依次为胃液消化组＞胃酸对照组＞胃空白对照组，说明胃蛋白酶和胃酸环境对羟自由基清除能力有一定的影响。模拟肠消化阶段，肠液消化组0.5 h时，羟自由基清除能力显著上升（p＜0.05），在1.5 h后有所下降；
肠空白对照组0.5 h时，显著下降（p＜0.05），最终肠液消化组的清除能力略高于肠空白对照组，这表明胰蛋白酶和胆汁前期可增强羟自由基清除率，后期受到环境等多方面影响导致羟自由基清除率下降。观察图1、图4～图6可知，紫薯桑葚复合口服液在模拟肠消化过程中总酚含量与DPPH、ABTS+和羟自由基清除能力变化规律相似，表明模拟肠消化过程中酚类化合物在抗氧化活性中作用效果明显。
2.5 模拟胃肠消化过程中活性物质含量与抗氧化能力之间相关性分析
活性物质含量与抗氧化能力相关性分析见表5。
表5 活性物质含量与抗氧化能力相关性分析Table 5 Correlation analysis between active substance content and antioxidant activity
如表5所示，在模拟胃消化过程中黄酮含量与DPPH自由基清除率、羟自由基清除率相关性显著（p＜0.05），相关系数分别为0.879和0.910，黄酮含量与ABTS+自由基清除率相关系数为0.336，说明两者相关性不高；
花色苷含量与DPPH自由基清除率之间相关系数为0.902，两者相关性显著（p＜0.05），花色苷含量与ABTS+、羟自由基清除率相关系数分别为0.542和0.821，相关性不显著（p＜0.05）。在模拟肠消化阶段总酚含量与DPPH、ABTS+及羟自由基清除率呈现良好正相关性（p＜0.05），相关系数分别为 0.919、0.921和0.924。总的来说模拟胃消化过程中，胃蛋白酶作用有利于抗氧化活性物质释放，且黄酮与花色苷含量对抗氧化活性贡献较高，模拟肠消化过程中多酚类化合物在抗氧化活性中起重要作用。
本试验以紫薯和桑葚为主要原料，通过正交试验优化了口服液最佳配方：紫薯提取液与桑葚汁以4∶3的质量比复合，按紫薯提取液与桑葚汁复合添加量95.98%、白砂糖添加量4%、柠檬酸添加量0.02%进行调配时，口感最佳。采用体外模拟胃肠消化法，检测口服液活性物质释放规律。在体外模拟胃消化阶段活性物质含量总体呈上升趋势，其中总酚含量上升了1.31%、黄酮含量上升了4.67%、花色苷释放量提高了2.81%；
在体外模拟肠消化阶段，总酚含量显著上升（p＜0.05）。此外经过体外模拟消化后，抗氧化能力均有所增强，这表明紫薯桑葚复合口服液具有较好的抗氧化活性，经相关性分析进一步验证了不同消化阶段活性物质含量与抗氧化能力呈良好的相关性。此研究对开发紫薯和桑葚保健类产品具有一定的技术指导与参考价值。
