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张驰 王国玉 陈军 崔琮 曹俊杰
(承德医学院附属医院 1神经内科,河北 承德 067000;2老年病科;3中国人民解放军91236部队医院)
高血压在老年人群中发病率高达40%～50%，具有血压波动大、收缩压明显增高、晨峰高血压等特点，可导致心、脑、肾等多种靶器官损害。调查显示，我国高血压患者数目达3.3亿，其中约75%伴有血浆同型半胱氨酸(Hcy)增高，称为H型高血压〔1〕。研究证实，高血压状态及高Hcy血症在导致靶器官损害上有明显协同作用〔2〕。肾损害是高血压常见的靶器官损害之一，是导致肾硬化和终末期肾病的重要原因〔3〕。临床常以降压药物控制血压来防治老年高血压肾损害，但老年患者常合并多种基础疾病，对药物的耐受性降低，治疗较青中年患者更复杂，疗效受限。研究发现高血压肾损害具有人群异质性，属于多基因遗传病，与多种基因多态性相关〔4〕。亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是Hcy代谢过程中的关键酶之一，其基因C667T位点突变是诱发H型高血压的重要原因〔5，6〕。研究发现，MTHFR C677T基因突变参与了高血压心脑血管动脉粥样硬化的病理过程，是高血压并发心、脑靶器官损害的危险因素〔7〕，但目前关于MTHFR C677T基因多态性与H型高血压肾损害的相关性研究报道少见。本研究拟分析MTHFR C677T基因多态性与H型高血压肾损害的关系。
1.1研究对象 本研究通过医院医学伦理委员会审批，所有受试者签署知情同意书。选取2020年8月至2021年4月承德医学院附属医院老年病科及全科医疗科198例老年H型高血压患者，其中男121例、女77例，平均年龄(70.19±5.68)岁，高血压病程(8.24±1.75)年。纳入标准：(1)确诊为H型高血压；
(2)年龄60～80岁；
(3)各项临床资料清晰完整。排除标准：(1)继发性高血压；
(2)原发性肾疾病；
(3)合并糖尿病、甲状腺疾病、恶性肿瘤、血液系统疾病、免疫性疾病、肝肾功能障碍、急慢性感染及严重心脑血管疾病者；
(4)近3个月内有手术或输血史；
(5)近3个月内有维生素(V)B6、VB12、叶酸等影响Hcy代谢药物治疗史。
1.2诊断标准及分组 H型高血压诊断标准〔8〕：原发性高血压，且血浆Hcy水平≥10 μmol/L。高血压肾损害诊断标准〔9〕：原发性高血压，且估算的肾小球滤过率(eGFR)<90 ml/(min·1.73 m2)。eGFR使用简化肾脏病膳食改良实验(MDRD)公式计算，eGFR=175×肌酸酐(Cr)-1.23×年龄-0.18×性别(男=1.00，女=0.79)。将H型高血压患者根据是否合并肾损害分为高血压肾损害(HRD)组(n=75)和单纯高血压(HNRD)组(n=123)，另选取同期体检的老年非高血压患者为对照组(n=40)。
1.3一般资料收集 收集所有受试者性别、年龄、高血压病程(H型高血压)、体重指数(BMI)、吸烟史、饮酒史、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、高血压家族史。
1.4样本采集 所有受试者在入院第2日采集清晨空腹外周静脉血3 ml×2，其中3 ml放入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管摇匀，-80℃下保存，用于基因多态性检测；
另3 ml同样加入抗凝管，用于生化指标检测。
1.5实验室生化指标检测 由专业检验科人员使用全自动生化分析仪(7600型，日本日立)进行Hcy、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、糖化血红蛋白(HbA1c)、Cr、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)等生化指标的测定，酶联免疫吸附试验(ELISA)应用DG022A型酶联免疫检测仪，试剂盒购自北京九强生物技术有限公司。
1.6基因多态性检测 MTHFR C677T基因型检测：全血冷冻样本经37℃水浴融化后，取500 μl加入DNA快速提取试剂盒中，核酸提取试剂购自上海复星长征有限公司，使用全自动磁珠核酸提取仪(SLE-E13200)进行DNA提取，-20℃保存。使用实时定量聚合酶链反应(PCR)(PCR-荧光探针法)进行MTHFR C677T基因片段的扩增，仪器为实时荧光定量PCR仪(Cobas-z-480)，基因检测试剂盒购于深圳泰乐德医疗有限公司。MTHFR C677T扩增引物序列：上游：5′-TGAAGAGAAGGTGTCTGCGGA-3′；
下游：5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′。引物由北京阅微基因技术有限公司提供。PRC体系：50 μl，模板DNA 2 μg，2×Master Mix 25 μl，上下游引物各2 μl。PCR条件：第一阶段50℃ 2 min 1个循环；
第二阶段95℃ 2 min 1个循环，第三阶段95℃ 15 s、60℃ 1 nin 45个循环；
信号收集：第三阶段60℃时收集FAM和VIC荧光信号，执行实时PCR。根据PCR和荧光法检测MTHFR C677C/T多态性位点的基因型。根据最终循环两荧光通道数据在二维坐标进行基因分型。
1.7统计学方法 采用SPSS24.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验、χ2检验；
Hardy-Weinberg遗传平衡的检验采取χ2检验；
并应用Logistic回归模型分析H型高血压合并肾损害的影响因素。
2.1各组一般资料及实验室指标比较 与对照组相比，HRD组及HNRD组SBP、DBP、Hcy、TC、LDL-C、Cr、BUN、UA水平及有高血压家族史比例均明显更高(P<0.05)；
与HNRD组相比，HRD组Hcy、LDL-C、Cr水平明显更高，高血压病程明显更长(P<0.05)。3组性别、年龄、BMI等其他指标差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。
表1 各组一般资料及实验室指标比较
2.2Hardy-Weinberg遗传平衡检验 HRD组、HNRD组和对照组MTHFR C677T基因型包括CC型、CT型、TT型，各组MTHFR C677T基因型均符合Hardy-Weinberg遗传平衡(χ2=0.483、0.599、1.042，P均>0.05)，群体代表性良好。
2.3各组MTHFR C677T基因型和等位基因分布频率比较 与对照组相比，HRD组及HNRD组CC基因型频率明显更低(P<0.05)，且HRD组CC基因型频率明显低于HNRD组，CT基因型频率明显高于HNRD组(P<0.05)；
3组TT基因型频率差异无统计学意义(P>0.05)。HRD组及HNRD组C等位基因及T等位基因分布频率与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)；
且HNRD组与HRD组C等位基因及T等位基因分布频率差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
2.4H型高血压合并肾损害相关因素的Logistic回归分析 以H型高血压是否合并肾损害为因变量，以单因素分析中有统计学意义的指标为自变量(高血压病程、Hcy、Cr、LDL-C赋值均为原值，MTHFR C677T基因型赋值以CC型或CT型=0、TT型=1)，行多因素Logistic回归分析，结果显示，高血压病程、Hcy、Cr、LDL-C及MTHFR C677T基因T等位基因是H型高血压患者发生肾损害的独立影响因素。见表3。
表2 各组MTHFR C677T基因型和等位基因分布频率比较〔n(%)〕
表3 H型高血压合并肾损害相关因素的Logistic回归分析
老年H型高血压患者由于肝肾功能减退、代谢功能下降，对降压药物的敏感性和耐受性较青中年患者变化明显，更易发生药物不良反应，给临床防治高血压肾损害带来一定难度。研究表明〔10〕，MTHFR基因多态性在多种疾病如H型高血压、肾衰竭等的发生发展中作用重要。叶酸循环是蛋氨酸代谢的重要组成部分，MTHFR则是叶酸循环中的关键代谢酶，可降低Hcy浓度。MTHFR基因的第677位密码子易发生不耐热错义突变(C突变为T)，使丙氨酸(Ala)因此转变为缬氨酸(Val)，MTHFR热稳定性下降，活性也随之下降，N5-甲基四氢叶酸合成不足导致Hcy甲基化供体缺乏，最终造成Hcy代谢受阻，细胞内外Hcy浓度上升。H型高血压即是原发性高血压合并高Hcy血症，研究〔11〕证实，MTHFR参与了H型高血压的病理过程，其作用机制可能在于：MTHFR 的CT、TT基因型活性明显较CC型降低(65%、30% vs 100%)，导致Hcy代谢障碍，Hcy含量升高而发为高Hcy血症。Bottiglieri〔12〕也指出，MTHFR C677T基因多态性是血浆Hcy水平出现中、重度增高的原因之一。对比国内外不同人群的MTHFR C677T基因中T等位基因突变情况，以非洲人群的频率最低(4.9%～9%)，欧洲人群最高(24%～40%)，中国人群则在30%～60%〔13，14〕，处于较高水平。向海卿等〔15〕研究也提示MTHFR C677T基因多态性是H型高血压的危险因素。因此，根据MTHFR基因型予以老年患者个性化治疗，可能更有效地防治高血压肾损害，进而降低患者的治疗费用、节约医疗资源。本研究结果显示，对照组、HNRD组、HRD组的T等位基因分布频率与既往上述结果基本相符〔15〕，提示H型高血压发生率高是中国高血压人群特征之一，临床应对患者血浆Hcy水平予以关注。
高Hcy浓度可增强血液黏度、损伤血管内皮细胞等，造成血栓、血管内皮功能障碍，这可能是高Hcy血症可诱发多种疾病的基础。Pushpakumar等〔16〕发现，Hcy可通过DNA低甲基化、氧化还原信号等机制和途径来诱发肾血管重构，导致肾小球、肾小管损伤。Dong等〔17〕发现，高血压患者肾功能的下降与MTHFR C677T基因多态性关系密切。故可推测MTHFR C677T基因多态性可能通过提高Hcy浓度来诱发肾损害。王海利等〔18〕也提示高血压患者的Hcy水平与靶器官损伤程度呈正相关。本研究提示MTHFR C677T基因多态性与H型高血压患者肾损害的发生密切相关。LDL-C、Cr水平均是H型高血压肾损害的独立危险因素。这可能由于Hcy可通过加重机体氧化应激反应来增加外周血中的脂质过氧化产物，刺激损伤血管内皮细胞〔19〕；
高Hcy也会激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)、刺激血管紧张素Ⅱ分泌，将进一步加重高血压，损伤肾功能〔20〕。提示高血压和高Hcy血症在肾损害上可能具有协同作用。Qin等〔21〕研究还指出，MTHFR C677T基因多态性除影响Hcy浓度外，还影响叶酸对高血压的疗效，其结果显示，TT基因型患者在使用叶酸后血浆Hcy并无明显降低，这可能与MTHFR TT基因型活性过低有关。提示临床在诊治H型高血压患者时还应关注其MTHFR C677T基因型，避免盲目用药，增加患者经济和生理负担。
综上，MTHFR C677T基因多态性与老年H型高血压患者肾损害易感性密切相关，等位基因T会增加老年H型高血压患者发生肾损害的风险。临床对于H型高血压患者可予以基因型检测，为临床用药提供科学依据，以期改善预后。
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