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L-苏氨酸的生产方法主要有微生物发酵法[17-18]、蛋白质水解法和合成法[19],其中微生物发酵法工艺简单,成本低,是当前的主流方法。在发酵法生产L-苏氨酸过程中,发现提取母液中甘氨酸质量浓度较高,而发酵液中甘氨酸质量浓度较低。为探究母液中甘氨酸的来源,笔者对各生产环节的氨基酸质量浓度进行监测,最终确定是温度和pH变化导致L-苏氨酸降解,产生甘氨酸。发酵液过陶瓷膜,除去菌体,得到清液,清液经过浓缩、结晶、分离,得到母液[20]。在L-苏氨酸提取工艺中,一般L-苏氨酸清液的pH约为6,浓缩温度约50 ℃,温度和pH失控会影响产品质量。因此,笔者开展了L-苏氨酸稳定性研究并对其副产物进行测定。
1.1 材料与试剂
乙腈,色谱纯,德国Meker公司;甲醇,色谱纯,德国Meker公司;邻苯二甲醛试剂(OPA),安捷伦公司;硼酸缓冲液,安捷伦公司;L-苏氨酸标准品,Sigma公司;L-甘氨酸标准物质,Sigma公司;二水合磷酸二氢钠;氢氧化钠;盐酸;乙醛,麦克林;2,4-二硝基苯肼,Sigma公司;所有药品均为国药分析纯。
1.2 仪器与设备
高效液相色谱仪1200,Agilent Technologies;Mili-Q超纯水机;电子天平(精度±0.000 1 g),梅特勒;真空泵,津腾;pH计,梅特勒;电子万用炉,北京永光明。
1.3 实验方法
1.3.1 样品前处理
L-苏氨酸发酵液10 000 r/min离心5 min,得到L-苏氨酸清液。首先,分别吸取20 mL清液置于3支试管中;然后,分别吸取纯水5 mL、6 mol/L的氢氧化钠溶液5 mL、6 mol/L的盐酸溶液5 mL,依次滴入盛有L-苏氨酸清液的试管中,混匀;最后,从每支试管中各取10 mL样液,密封,分别20,40,60,80,100 ℃水浴处理30 min,取出冷却。分别检测处理前后样液的pH以及L-苏氨酸、甘氨酸和乙醛的质量浓度。
1.3.2 检测方法
测定氨基酸质量浓度的方法主要有HPLC法[21-22]、氨基酸分析仪法[23]、茚三酮法[24]、纸层析法[25-26]、甲醛滴定法[27]和酶法[28]等,笔者采用的是HPLC法。
1) HPLC色谱柱衍生法测定氨基酸质量浓度
实验组患者主诉良好达到100%(55例),并表示愿意再次接受检查治疗;常规组患者主诉良好,且表示愿意再次接受诊疗的患者占比76.36%(42例),两组数据比较具有统计学意义(P<0.05,X2=14.7423)。
流动相A的制备:称取6.24 g二水合磷酸二氢钠,转移到1 000 mL玻璃烧杯中,加入1 000 mL超纯水,搅拌,直至晶体完全溶解,用氢氧化钠调节溶液pH至7.8。
流动相B的制备:准确量取各试剂并混匀,V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=45∶45∶10。
色谱条件:色谱柱ZORBAX Eclipse AAA 4.6 mm×75 mm 3.5-Micron,柱温40 ℃,检测波长338 nm,流速2.0 mL/min,OPA柱前衍生。
洗脱条件:流动相A,B按不同比例混合,梯度洗脱程序见表1。
表1 梯度洗脱程序
标准曲线绘制:准确称取L-苏氨酸标准物质0.1 g,先用蒸馏水定容至100 mL,配制成1 g/L的标准溶液,再分别稀释成不同质量浓度的溶液备用,即0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 g/L。将不同质量浓度的标准溶液采用HPLC法进行色谱分离,以峰面积为纵坐标,标品质量浓度为横坐标,绘制标准曲线方程。
样品稀释处理:将待测样品稀释到质量浓度到标准曲线中间点0.5 g/L的附近,摇匀,用0.22 μm的滤膜过滤。将处理好的试样上机编序列,进行柱前衍生色谱分离测定。
2) HPLC衍生法测乙醛质量浓度
流动相为V(乙腈)∶V(水)=65∶35,色谱条件为色谱柱C18-A(250 mm×4.6 mm×5 μm),柱温30 ℃,进样量10 μL,波长360 nm。
衍生剂的制备:称取1 g的2,4-二硝基苯肼置于1 000 mL的容量瓶中,加入6 mL的85%磷酸,用乙腈定容至1 000 mL。
标准品的制备:称取约0.01 g乙醛标准品,用乙腈定容至100 mL,摇匀。取0.1 mL配制好的乙醛标准品置于10 mL容量瓶中,加入1 mL衍生剂,摇匀后用乙腈定容至10 mL,在室温下放置25 min,用0.22 μm有机相针式滤器过滤,上机检测。
样品的制备:取1 mL样品于10 mL容量瓶中,加入1 mL衍生剂,摇匀后用乙腈定容至10 mL,在室温下放置25 min,用0.22 μm有机相针式滤器过滤,上机检测。
在发酵代谢途径中,L-苏氨酸可分解为两碳甘氨酸和两碳乙醛,通过对L-苏氨酸代谢途径、代谢副产物成分及理化性质的分析,得出温度和pH是影响发酵液中L-苏氨酸分解的关键因素,因此笔者展开不同温度和pH的验证实验。
2.1 pH变化
将L-苏氨酸发酵液10 000 r/min离心5 min,得到L-苏氨酸清液。先分别吸取20 mL清液置于3支试管中,再分别吸取6 mol/L的盐酸溶液5 mL、纯水5 mL、6 mol/L氢氧化钠溶液5 mL，依次滴入盛有L-苏氨酸清液的试管中,分别得到pH为0.4,6.0,13.1的样液。样液分别经过20,40,60,80,100 ℃水浴处理30 min,当pH为0.4时,随着温度的升高,pH相差约±0.02;当pH为6时,随着温度的升高,pH相差约±0.02;当pH为13时,随着温度的升高,pH相差约±0.02,具体结果见表2。由表2可知:不同pH的L-苏氨酸样液,经不同温度加热处理,pH无变化。
表2 不同温度下pH的变化
2.2 L-苏氨酸质量浓度变化
取L-苏氨酸发酵液10 000 r/min离心5 min,得到L-苏氨酸清液,分别吸取20 mL清液于试管中,再分别吸取6 mol/L盐酸和纯水各5 mL,得到pH为0.4和6的样液,分别经过20,40,60,80,100 ℃水浴处理后,L-苏氨酸质量浓度相差小于0.3 g/L,可视为相同;吸取20 mL清液于试管中,再吸取6 mol/L氢氧化钠,得到pH为13.1的样液,分别经过20,40,60,80,100 ℃水浴处理后,在80 ℃条件下,L-苏氨酸开始逐渐分解,100 ℃时分解加剧,L-苏氨酸降解了9.0 g/L,具体见表3。由表3可知:在酸性和中性加热条件下L-苏氨酸较稳定;在碱性加热条件下L-苏氨酸开始分解,质量浓度降低,降解率约10%。
表3 不同温度下L-苏氨酸质量浓度的变化
2.3 甘氨酸质量浓度变化
L-苏氨酸发酵液经过前处理后,得到pH为0.4,6的样液,经不同温度处理后,甘氨酸质量浓度相差约0.01 g/L,L-苏氨酸的质量浓度不变;L-苏氨酸发酵液经前处理后得到pH为13.1的样液,在80 ℃条件下,甘氨酸质量浓度开始提高,在100 ℃时约提高4 g/L,加热后甘氨酸质量浓度提高了3.5 g/L,具体结果见表4。由表4可知:在酸性和中性加热条件下L-苏氨酸较稳定,在碱性加热(80,100 ℃)条件下甘氨酸质量浓度提高。
表4 不同温度下甘氨酸质量浓度的变化
2.4 乙醛质量浓度变化
L-苏氨酸发酵液经过前处理后得到pH为0.4,6的样液,经不同温度处理后,检测到乙醛质量浓度为0;L-苏氨酸发酵液经过前处理后得到pH为13.1的样液,经不同温度处理后,乙醛质量浓度在100 ℃时约提高0.002 g/L,具体结果见表5。由表5可知:只有在100 ℃,pH 13.1加热条件下,才能检测到乙醛。
表5 不同温度下乙醛质量浓度变化
2.5 母 液
取5批不同批次的L-苏氨酸发酵液和母液,分别检测L-苏氨酸和甘氨酸质量浓度,其中1,2,3批母液中L-苏氨酸质量浓度为115～119 g/L,甘氨酸为16～17 g/L;4,5批母液中L-苏氨酸质量浓度下降到约75 g/L,甘氨酸质量浓度提高了35 g/L;发酵液中L-苏氨酸质量浓度为110 g/L,甘氨酸为0.4 g/L,具体结果见表6。一般母液中L-苏氨酸质量浓度约115 g/L,而4,5两个批次中L-苏氨酸质量浓度偏低,值为40 g/L,甘氨酸质量浓度提高到约原来的2倍。分析其原因:样液4,5批清液的pH约13,在提取工艺中温度失控,约为80 ℃,导致L-苏氨酸分解成甘氨酸,甘氨酸在母液中残留积累。因此,在提取工艺中,要严格遵照标准,避免由于操作失误或仪器失控引起料液分解,确保产品质量。发酵液液相色谱峰图如图1所示,母液液相色谱峰图如图2所示。
表6 发酵液和母液中L-苏氨酸和甘氨酸质量浓度
1—甘氨酸;2—L-苏氨酸。
1—甘氨酸;2—L-苏氨酸。
L-苏氨酸发酵液的稳定性受温度和pH的影响。笔者采用不同pH和温度进行验证,得出L-苏氨酸发酵液在酸性、中性条件下稳定,在碱性加热(80,100 ℃)条件下,分解为甘氨酸。实验结果表明:不同批次的L-苏氨酸、甘氨酸质量浓度差异较大,其中母液4,5批在提取过程中温度高于80 ℃,pH为13,此时L-苏氨酸分解,甘氨酸质量浓度提高。故在L-苏氨酸提取工艺中,要严格控制温度和pH,确保它们在规定范围内,以防止L-苏氨酸分解,保证产品质量。
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