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李 苏，陈昌威，付靖雯，张梦雪，李志伟，陈 洋，叶静静，盘赛昆，b，c，d，2
(1.江苏海洋大学 a.食品科学与工程学院; b.江苏省海洋生物技术重点实验室；
c.江苏省海洋生物资源与环境重点实验室；
d.江苏省海洋生物产业技术协同创新中心，江苏 连云港 222005；
2.江苏省海洋资源开发研究院，江苏 连云港 222005)
浒苔(Enteromorphaspp.)为绿藻门(Chlorophyta)、石莼目(Ulvales)、石莼科(Ulvaceae)的一类大型经济绿藻，藻体呈绿色，由单层细胞组成[1-2]。浒苔不具有毒性，但大量繁殖易爆发绿潮，影响水体及海洋生物，破坏海洋生态系统[3]。浒苔营养物质丰富，粗多糖含量高达35%～50%，具有抗癌、抗氧化、免疫调节、降血脂等多种生物活性，是一种天然的营养食品原料[4-5]。
多糖降解的主要方法有物理降解法、化学降解法和酶解法。物理降解法和化学降解法能够将多糖降解为寡糖，但也会对糖链基团结构造成破坏；
酶解法是当前降解植物多糖的主要方法，酶解法适用范围广且安全，成本较低，无副作用，对环境不会造成污染，生产过程易控制，产物得率较高，糖的结构保存较为完整[6-7]。酶法降解条件温和, 可避免硫酸基团的脱落, 能获得真正的苷元[8]。Yu等[9]通过酶解法降解海参褐藻分离出4种寡糖；
李银停[10]对坛紫菜多糖进行酶解，得到具有潜在降低胆固醇功能活性的低聚糖。
目前，国内外对浒苔多糖酶解物的研究主要集中在制备、结构、抗氧化等方面[11-13]，对条浒苔多糖酶解物降血脂活性研究较少。本文研究了一种适合条浒苔多糖降解成具有降血脂功能活性的酶解物的制备工艺，以还原糖生成量、牛磺胆酸钠吸附性和甘氨胆酸钠吸附性为指标，通过单因素试验确定多糖酶解最适条件，采用响应面试验优化酶解条件，以期为条浒苔多糖酶解物的开发利用提供理论基础。
1.1 材料与试剂
条浒苔采自浙江舟山，用洁净海水清洗，自然风干备用。纤维素酶(5×104U/g)、果胶酶(6×104U/g)、糖化酶(1×105U/g)，河南万邦化工科技有限公司；
胰蛋白酶(2.5×105U/g)、胃蛋白酶(3×106U/g)，北京索莱宝科技有限公司；
甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠(纯度97%)，上海麦克林生化科技有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与主要设备
ZNC-701超微粉碎机，北京兴时利和发展有限公司；
GZ98-Ⅲ超声破碎仪，无锡罡正科技有限公司；
CMD2000/4型湿法超微粉碎机，切可(上海)机械设备有限公司；
SP-754紫外分光光度计，上海光谱仪器有限公司；
冷冻干燥机，郑州宏朗仪器设备有限公司。
1.3 原料前处理工艺优化
将干条浒苔进行粗粉碎，按照料液比1∶20溶于水中，采用超声辅助破碎(500 W，50 min)，酶法提取(纤维素酶添加量为质量分数5%、酶解时间6.5 h)，湿法超微粉碎(40 Hz，30 min)的不同组合方式对条浒苔溶液进行多糖提取，筛选出超声波粉碎法、湿法超微粉碎和酶法联合提取条浒苔多糖最优的提取工艺。前处理工艺方案见表1。
表1 条浒苔多糖提取前处理工艺方案
1.4 多糖提取工艺流程
1.5 筛酶试验
取2.5 g条浒苔粗多糖溶于500 mL乙酸-乙酸钠缓冲液(pH=3.5)，配制成5 mg/mL样液。取0.02 g果胶酶溶于乙酸-乙酸钠缓冲液(pH=3.5)、0.012 g糖化酶溶于乙酸-乙酸钠缓冲液(pH=4.5)、0.024 g纤维素酶溶于乙酸-乙酸钠缓冲液(pH=4.8)，分别定容至100 mL，配制成12 U/mL酶溶液。取样液50 mL、酶溶液10 mL各自保温15 min，混匀，于50 ℃反应，沸水浴灭酶。
1.6 条浒苔低聚糖制备
参考文献[14]精确称取1.0 g条浒苔多糖溶于100 mL蒸馏水，配制成10 mg/mL多糖溶液。按“1.5”方法筛选出最适酶并酶解多糖，酶解结束立即煮沸10 min灭酶，冷却，用孔径大小为300 Da规格的透析袋装入酶解多糖溶液，透析除盐。透析液冷冻干燥得降解条浒苔多糖，冷藏储存备用。
1.6.1 酶解工艺优化 参考文献[15]以还原糖生成量、牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠吸附性为指标，考察底物质量浓度、酶解时间、酶解温度、pH、酶添加量对条浒苔多糖酶解的影响。试验设计为：配制100 mL条浒苔多糖溶液，在纤维素酶初始酶添加量12 U/mL、底物质量浓度10 mg/mL、酶解温度50 ℃、初始pH为7、酶解时间3 h条件下分别研究不同酶添加量(6，12，18，24，30 U/mL)，底物质量浓度(2,6,10,14,18 mg/mL)，酶解温度(45，50，55，60，65 ℃)，pH(5，6，7，8，9)和酶解时间(1，2，3，4，5 h)的影响，每组试验重复3次。
1.6.2 响应面试验设计 利用Design-Expert 8.0.6的Box-Behnekn试验设计原理进行响应面优化试验。根据单因素方差分析的试验结果，确定最优酶解工艺，以还原糖生成量为指标，选择酶添加量、酶解温度、pH、酶解时间设计四因素三水平试验方案。因素设计和水平见表2。
表2 响应面试验因素与水平
1.7 指标测定
1.7.1 粗多糖含量测定 参考文献[16]并略作改动，采用平板称质量法测定不同前处理工艺的多糖质量，根据公式(1)计算多糖得率。
(1)
1.7.2 还原糖生成量测定 采用DNS比色法[17]测定还原糖含量。吸取反应液1 mL，加入3 mL DNS试剂，混匀，沸水浴加热10 min，冰浴冷却，定容至25 mL，摇匀，490 nm处测定吸光度，根据葡萄糖标准曲线计算还原糖生成量。
1.7.3 胆酸盐标准曲线的制作 参照文献[18]的方法并略作修改，分别制作牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠的标准曲线。配制浓度为0，0.03，0.06，0.12，0.18，0.24，0.30 mmol/L的甘氨胆酸钠溶液和浓度为0，0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 mmol/L的牛磺胆酸钠溶液。取不同浓度的标准溶液2 mL分别置于不同的25 mL具塞比色管中，每只试管分别加6 mL质量分数60%的H2SO4溶液，70 ℃水浴15 min，取出冰浴5 min，387 nm处测定吸光度。以胆酸盐浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，分别制作牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠标准曲线。
1.7.4 胆酸盐结合试验 参照文献[19]的方法并略作修改，分别以不同的酶添加量、底物质量浓度、酶解温度、pH及酶解时间，吸取5 mL经透析除盐、冻干复溶后的条浒苔多糖溶液置于两个100 mL三角瓶中，每个三角瓶分别加3 mL 10 mg/mL的胃蛋白酶溶液和1 mL 0.01 mol/L的HCl溶液，37 ℃恒温振荡器内振荡1 h(模拟胃消化环境)。随后用0.1 mol/L的NaOH溶液调节pH至6.3，加4 mL 10 mg/mL的胰蛋白酶溶液，37 ℃下恒温振荡器内振荡1 h(模拟肠道环境)。一份三角瓶加4 mL 0.4 mmol/L的牛磺胆酸钠，另一份三角瓶加4 mL 0.4 mmol/L的甘氨胆酸钠，37 ℃恒温振荡器内振荡1 h，取出，5 000 r/min离心15 min，取上清液，387 nm处测吸光度，重复3次，按照各自标准曲线计算甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠剩余量。加入的甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠总量与剩余量差值为吸附量。根据公式(2)和(3)分别计算牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠吸附率。
(2)
式中：C0为牛磺胆酸钠加入量，μmol；
C1为牛磺胆酸钠剩余量，μmol。
(3)
式中：C2为甘氨胆酸钠加入量，μmol；
C3为甘氨胆酸钠剩余量，μmol。
1.8 统计分析
采用IBM SPSS Statistics 23软件对试验结果进行处理，采用Excel和Origin 2018软件绘图，采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面参数优化及方差分析。
2.1 三法联用提取多糖工艺
6种前处理工艺对条浒苔多糖得率的影响均不相同(见图1)。组合B(超声辅助酶法之后进行湿法超微粉碎)的条浒苔多糖得率最高，为(7.88±0.51)%；
组合F(湿法超微粉碎之后进行超声辅助酶法)的条浒苔多糖得率为(7.70±0.56)%。原因可能是超声波破碎产生的空洞效应和振动使条浒苔紧密结合的细胞壁成分之间的关联受到破坏，然后加纤维素酶分解细胞壁结构，最后进行湿法超微粉碎，破坏了细胞壁结构，提高了多糖溶出的含量[20]。
图1 不同前处理工艺对条浒苔多糖得率的影响
2.2 不同酶降解条浒苔多糖结果比较
不同酶对条浒苔多糖降解效率的影响见图2。
图2 不同酶对条浒苔多糖降解效率的影响
纤维素酶的酶解效果明显高于果胶酶和糖化酶，三者还原糖生成量分别为(45.92±1.62)mg/mL，(16.25±1.29)mg/mL，(37.40±1.24)mg/mL。因此选用纤维素酶作为条浒苔多糖的水解酶，结合本试验最优前处理和酶解工艺对条浒苔多糖进行酶解，酶解产物用于体外降血脂研究。目前研究表明，专一性水解酶和非专一性水解酶为降解多糖的主要水解酶[20]，且主要以内切方式进行，糖化酶可水解α-1，4和少量的α-1，6糖苷键，果胶酶可以切断α-1，4糖苷键，纤维素酶可以水解β-1，4糖苷键。条浒苔细胞壁由部分纤维素构成，它由葡萄糖经过β-1，4糖苷键连接而成[21]，其多糖的糖苷键类型主要有β-1，4和少量的α-1，4等[22]。试验结果表明，纤维素酶对条浒苔多糖的降解效果优于果胶酶和糖化酶。
2.3 单因素试验
2.3.1 标准曲线 按“1.7.2”方法绘制葡萄糖标准曲线，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，回归方程为：Y=0.797 7X+0.036 7，R2=0.991 9，线性关系良好。
按“1.7.3”方法绘制牛磺胆酸钠标准曲线，以牛磺胆酸钠浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，回归方程为：Y=1.252 1X+0.007 5，R2=0.998 5，线性关系良好。
按“1.7.3”方法绘制甘氨胆酸钠标准曲线，以甘氨胆酸钠浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，回归方程为：Y=1.894 8X+0.007 4，R2=0.991 7，线性关系良好。
2.3.2 酶添加量的影响 酶添加量对条浒苔多糖降解效率的影响如图3所示。
图3 酶添加量对条浒苔多糖降解效率的影响
当酶添加量小于12 U/mL时，还原糖生成量、牛磺胆酸钠吸附率和甘氨胆酸钠吸附率都随着酶添加量的增加而上升，当酶添加量达到12 U/mL时，还原糖生成量、牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠吸附率都达到最高值，此时还原糖生成量为(70.69±0.67)mg/mL，牛磺胆酸钠的吸附率为(42.50±0.73)%，甘氨胆酸钠吸附率为(47.80±0.71)%,高于海带和坛紫菜多糖酶解产物对胆酸盐的吸附能力[10,23]。之后，较高的酶浓度会使多糖过度水解，生成活性较差的酶解物，导致还原糖生成量、牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠吸附率下降[24]。
2.3.3 酶解温度的影响 酶解温度对条浒苔多糖降解效率的影响如图4所示。
图4 酶解温度对条浒苔多糖降解效率的影响
由图4可知，随酶解温度的升高，还原糖生成量及牛磺胆酸钠和胆酸盐钠吸附率均呈先上升后下降趋势。当温度为50 ℃时，还原糖生成量及牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠吸附率均达到最高，分别为(70.94±0.94)mg/mL，(40.31±0.87)%和(46.88±0.83)%。温度超过50 ℃后，还原糖生成量、牛磺胆酸纳和甘氨胆酸钠吸附率均呈下降趋势。原因可能是温度过高导致酶的次级键断裂，造成蛋白质空间结构发生改变，从而降低酶解效率[25]，大分子多糖降解为生物活性更高的小分子糖的效率下降，糖的活性降低，降低了胆酸盐的吸附能力[26]。
2.3.4 pH的影响 pH对条浒苔多糖降解效率的影响如图5所示。
图5 pH对条浒苔多糖降解效率的影响
pH=7时,还原糖生成量及牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠吸附率都达到最大值，分别为(72.16±0.81)mg/mL，(37.92±1.03)%和(50.42±0.77)%。pH对酶活中心必需基团解离程度有一定影响，pH过高或者过低都会抑制酶的活性，从而影响浒苔多糖降解效率[27]。pH=7条件下，还原糖生成量达到最高，牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠属于结合胆酸盐，此条件下两种胆酸盐侧链末端的磺酸基和羧基离子化程度高，更利于活性基团暴露和还原糖的结合[28]。
2.3.5 酶解时间的影响 酶解时间对条浒苔多糖降解效率的影响如图6所示。
图6 酶解时间对条浒苔多糖降解效率的影响
酶解时间在1～3 h，还原糖生成量和胆酸盐吸附率呈上升趋势；
3 h时还原糖生成量及牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠吸附率分别为(66.10±0.63)mg/mL，(39.27±0.57)%和(47.35±0.78)%，均为最高值；
3 h后均呈平缓趋势，原因可能是随酶解时间的延长，产物增加，底物中糖苷键与酶的作用减少[29]。
2.3.6 底物质量浓度的影响 底物质量浓度对条浒苔多糖降解效率的影响如图7所示。
图7 底物质量浓度对条浒苔多糖降解效率的影响
随着底物质量浓度的增加，到10 mg/mL时，还原糖生成量及牛磺胆酸钠吸附率和甘氨胆酸钠吸附率达到最高，分别为(69.86±0.81)mg/mL，(39.87±0.52)%和(49.23±0.70)%，之后趋于平缓，可能是由于随着底物浓度的增加，酶中心分子达到饱和状态[30]。
2.3.7 响应面试验 通过单因素试验结果的方差分析，筛选出对指标有显著影响的因素。为确定最优工艺，固定底物质量浓度为10 mg/mL，选择酶添加量、酶解温度、pH和酶解时间4个因素，采用Design-Expert 8.0.6的Box-Behnekn试验设计原理进行试验设计，结果见表3。
表3 响应面试验设计和结果
利用Design-Expert 8.0.6软件对试验数据进行二次多项式回归拟合，得到还原糖生成量与各因素二次回归方程模型为
Y1=70.61-0.30A-0.29B-0.18C+0.38D+1.13AB-1.39AC+1.43AD-1.58BC-0.85BD-0.26CD-2.75A2-2.56B2-3.13C2-1.88D2。
回归模型系数R2=0.984 5，P<0.000 1，模型极显著。校正系数RAdj2=0.969 0，说明该模型可以解释96.90%的响应值变化，各变量与响应值之间的关系可以用该方程来印证。从表4可知，失拟项P=0.932 9，失拟项不显著，说明还原糖生成量的实际值与预测值较拟合，实验误差小，能够较好地表述本试验结果。对回归模型进行显著性检验，一次项pH对还原糖生成量的影响不显著，时间A和温度B对还原糖生成量的影响为显著，加酶量D对还原糖生成量有极显著影响；
二次项对还原糖生成量的影响均为极显著；
交互项除了CD对还原糖生成量的影响不显著，其余均为极显著。根据F值可知，各因素排序为：加酶量(D)>时间(A)>温度(B)>pH(C)。
表4 还原糖生成量试验方差分析
固定4个因素其中之一，考察其他3个因素两两交互作用对条浒苔多糖酶解效果的影响。并根据回归方程绘制如图8所示响应面及等高线图。
a 酶解时间和酶解温度交互作用曲线
由图8a可知，酶解时间和酶解温度曲面都较陡，表明两者对还原糖生成量均有显著影响。由图8b等高线图可知，酶解时间在3 h内和酶解温度在45～51 ℃之间时，等高线较为平缓，其数值变化对还原糖生成量影响较小；
而酶解时间在3 h及酶解温度在51 ℃后，等高线比较陡峭，说明因素数值的变化对还原糖生成量影响较大，P<0.01。由此可知，酶解时间和酶解温度之间交互作用显著。
由图8c可知，还原糖生成量在酶解时间和pH上升呈现先上升后下降的趋势，曲面较陡，作用极显著。图8d所示等高线呈椭圆，在酶解时间和pH数值较小的情况下，等高线较为陡峭，说明酶解时间和pH两者交互作用较强，P<0.01，影响较显著。
由图8e、图8f可知，若固定pH和酶解温度不变，还原糖生成量随着酶解时间和加酶量的增加而先上升后下降，且酶解时间和加酶量曲面均较陡；
等高线呈椭圆形，且随着时间的增加，等高线越密集，表明酶解时间的变化对还原糖生成量影响较大，P<0.01，酶解时间和加酶量之间的交互作用对响应值影响较显著。
分析图8g可知，酶解温度和pH数值较小时的曲面较陡，对还原糖生成量影响表现十分显著。从图8h等高线图可以看出，酶解温度和pH在较低或较高时，等高线呈现均较为陡峭，表明酶解温度和pH数值的变化对还原糖生成量影响较大，P<0.01。由此得出，酶解温度和pH的交互作用对还原糖生成量影响较显著。
由图8i可知，酶解温度和加酶量曲面均呈陡峭状态，对还原糖生成量影响较为显著。图8j所示等高线呈椭圆形，在数值较小较密的情况下，酶解温度和加酶量对还原糖生成有较大影响，P<0.01，交互作用在此情况下也表现得十分明显。
由图8k、图8l可知，随着加酶量和pH的变化，加酶量曲线较为平滑，等高线近似圆形，P>0.05，证明加酶量和pH交互作用不明显，与方差分析结果一致。
利用Design Expert 8.0.6.1软件获得最佳酶解工艺因素组合：酶解时间2.96 h、酶解温度49.58 ℃、pH=7、酶添加量12.62 U/mL，此时还原糖生成量为70.65 mg/mL。考虑到实际操作的可行性，对优化条件进行如下调整：酶添加量12.6 U/mL、酶解温度49 ℃、pH=7、酶解时间2.9 h。在最佳工艺条件下验证模型预测的准确性，进行3次平行试验，还原糖生成量为(69.92±0.19)mg/mL，用SPSS对其进行T检验，得P1=0.98，大于0.05，无显著性差异，表明试验得到的实际值与预测值接近，可知本文所设计模型是可靠的。在此工艺条件下，条浒苔多糖酶解物对牛磺胆酸钠吸附率为(42.30±0.17)%，甘氨胆酸钠吸附率为(48.90±0.56)%，证明条浒苔多糖酶解物具有降血脂活性。
本文研究了酶法降解条浒苔多糖，通过单因素试验和响应面优化确定了条浒苔多糖酶解物制备的最佳工艺条件：酶添加量12.6 U/mL，酶解温度49 ℃，pH=7，酶解时间2.9 h。优化后还原糖生成量为(69.92±0.19)mg/mL。
体外降血脂结果表明，条浒苔多糖酶解物对牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠均有吸附作用，结合率分别达到(42.30±0.17)%和(48.90±0.56)%。与牛磺胆酸钠结合率相比，酶解物对甘氨胆酸钠的吸附率更高，具有一定的降血脂效果。这一结果为条浒苔高值化利用提供了一种新的思路，为条浒苔多糖酶解物的规模化生产提供了理论依据。
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