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邱永杰何松林张翔宇胡缓史来琨于嘉伦贾文庆
(河南科技学院园艺园林学院，河南 新乡 453003)
牡丹(Paeonia suffruticosa)是芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia)落叶灌木，因其华丽的姿态和美好的寓意，千百年来深受人们喜爱。近年来，随着人们对牡丹观赏价值的深入开发，其作为鲜切花的潜在价值被逐渐挖掘。然而，与月季、菊花、香石竹等其它畅销切花相比，牡丹花期短、花瓣脆弱及不易运输、难以持续保存的特点导致其在鲜切花市场上的流通受到限制，从而制约牡丹鲜切花产业发展[1，2]。大量研究表明有多种因素参与牡丹开花和衰老过程的调控，包括内源激素、膜质过氧化、大分子物质、水分代谢、呼吸代谢等[3]。近年来，通过施加外源保鲜剂延缓切花的衰老进程已经成为普遍的切花保鲜方式[4]，国内关于此类化学保鲜的研究多集中于保鲜液的成分。研究表明，以蔗糖为主要保鲜剂的配方对香石竹切花有良好的保鲜效果[5]；
赤霉素能有效延长蝴蝶兰、百合切花的保鲜时间[6，7]；
多胺、多效唑、比久可以明显延缓牡丹切花的寿命[8，9]。
植物花器官的开放和衰老包括花朵吸水扩展生长到失水萎蔫的过程，此过程中植物体内发生一系列生理学和细胞学上的变化。这些变化反映到表型特征上则表现为花朵直径大小、花色暗淡程度、花瓣褶皱程度、茎秆弯曲程度的变化等。在细胞和亚细胞水平上，研究发现，衰老的花瓣表皮细胞表现出液泡膜内陷、细胞壁变形且核糖体减少、DNA断裂，包括蛋白质、核酸、白色体、溶酶体等在内的细胞内组分发生自溶等，而关于细胞核形态变化的研究尚未见报道。植物的生命活动广泛存在细胞程序性死亡(PCD)。花器官的衰老作为植物衰老的一部分，是植物生长发育的一个阶段，也是一个细胞程序性死亡的过程。在这个过程中，植物体大量积累各种生理代谢的副产物，其中活性氧(reactive oxygen species，ROS)是主要的代谢产物，主要包括过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子()、羟自由基(·OH)、单线态氧(1O2)等，这些部分被还原或活化氧的衍生物，具有高活性和毒性，可以氧化破坏细胞，导致可溶性蛋白降解、膜脂过氧化程度升高、游离氨基酸积累以及多种酶活性变化等[10，11]。过量的ROS会触发植物体内抗氧化清除机制，引起酶清除系统中的SOD、POD、CAT等保护酶活性发生变化[12]，因此可以作为判断细胞PCD程度的关键性指标。
抗坏血酸(ASA)是植物体内重要的非酶类小分子抗氧化剂，能与谷胱甘肽(GSH)形成循环系统，在清除植物体内抗氧化酶不能清除的O2·-和·OH等自由基、阻止或减轻氧化伤害方面发挥重大作用[13，14]。陈娇等[15]研究指出，香蕉表面喷洒外源ASA推迟果实成熟衰老时间；
杨庆贺等[13]指出施加外源ASA能提高菊花对低温弱光的耐性。H2O2是一类ROS，会对植物细胞造成毒害作用，此外研究表明，H2O2还能作为一种信号分子参与信号转导，从而调节植物代谢、提高植物的抗逆性[16]。朱利君等[17]研究表明，高盐胁迫下外源H2O2介导抗氧化酶、ABA和GA可促进黄瓜种子的萌发；
蒋景龙等[18]研究指出，施加适宜浓度的外源H2O2可缓解低温胁迫下大红柑叶片的卷曲萎蔫，降低低温对柑橘叶片细胞膜的伤害。目前，关于施加外源ASA和H2O2对牡丹切花保鲜影响的研究尚未见报道。因此，本研究参考史国安等[19]的牡丹花自然开放进程分级标准，以‘凤丹’牡丹为试材，选择切花保鲜处理最适宜时期——破绽期牡丹花苞作为研究对象，研究不同浓度ASA、H2O2溶液对瓶插切花衰老和不同瓶插时期花瓣相关生理指标的影响，以进一步探究牡丹切花衰老过程中抗氧化系统的运作机制、衰老生理及细胞学特性，以期为牡丹切花的保存及开发利用提供理论和技术依据。
1.1 试验材料与地点
供试牡丹品种‘凤丹’(Paeonia ostii)取自河南科技学院牡丹资源圃。试验于2020年4月在河南省园艺植物资源利用与种质创新工程研究中心进行。
1.2 材料培养与处理
于基地剪取破绽期生长态势良好、大小一致的‘凤丹’切花，共分为7组(T1～T7)，每组6枝，分别置于盛有蒸馏水的切花瓶中培养，其中每组预留一枝用作外表形态观察和花径测量，不用作生理指标测定。处理组分别滴加提前配置好的H2O2与ASA溶液，使瓶插液浓度分别为2.5 mg/L ASA(T1)、5 mg/L ASA(T2)、10 mg/L ASA(T3)和0.003 mg/L H2O2(T4)、0.03 mg/L H2O2(T5)、0.3 mg/L H2O2(T6)，共6个处理组，对照组(T7)瓶插液为蒸馏水。将切花置于(22±1)℃室温下培养观察，全程保持自然光照，避免阳光直射。瓶插当日起，每日对切花的花径和生理指标进行测定:于每日上午8时用游标卡尺测量每瓶预留切花两个垂直方向的直径大小，取其平均值作为该支切花的花径；
分别取切花内、中、外轮花瓣的中间部位共0.5 g，切碎混匀，测定生理生化指标，每处理重复3次。
1.3 生理生化指标测定
采用考马斯亮蓝G-250法测定可溶性蛋白质含量(参考Bradford[20]的方法并加以修改)。氮蓝四唑(NBT)法测定SOD活性，愈创木酚法测定POD活性，紫外吸收法测定CAT活性[21]。根据硫代巴比妥酸(TBA)的三氯乙酸溶液与MDA的显色反应测定MDA含量[22]。
1.4 DAPI染色观察细胞核形态学特征
瓶插期间于每日上午8时分别取每个处理切花的中间层花瓣观察细胞核变化，即从距离花瓣基部三分之一处切取长2～3 mm、宽1～2 mm的小块，置于70%乙醇中固定2 h，之后用PBS缓冲液反复冲洗3次。将冲洗干净的切片材料置于载玻片上，吸干表面水分，滴加10μg/mL DAPI染液20μL，于黑暗处染色15 min，然后置于尼康OLYMBUS荧光倒置显微镜下观察拍照(荧光激发波长为UV330-380 nm)。判断细胞核完整性的标准:细胞核完整时位于细胞正中央、形态完整、边缘清晰圆滑，为标准的圆形，排列整齐。
1.5 数据整理与分析
采用Microsoft Execl制图，SPSS软件分析数据，Photoshop软件进行图片整合。
2.1 不同浓度ASA和H2O2对牡丹切花花径的影响
由图1(a)可以看出，外源不同浓度ASA处理牡丹切花直径变化显著，第4天时‘凤丹’切花花径达到最大值，为完全盛开状态；
第5天时浓度2.5、10 mg/L ASA处理切花的花径仍然保持在最大值，其它处理切花花径都存在一定程度缩减。这说明适宜浓度的ASA具有维持切花保鲜的作用。图1(b)表明，外源H2O2处理下，切花花径第2天时绽放程度明显低于对照，并且在接下来几天里始终低于对照。
图1 不同浓度ASA和H2O2处理‘凤丹’切花花径的变化
2.2 不同浓度ASA和H2 O2对牡丹切花SOD活性的影响
由图2(a)可知，第2天时各ASA处理花瓣内SOD活性均比对照低，第3天时10 mg/L ASA处理(T3)切花SOD活性显著升高且高于对照，到第5天处理组SOD活性整体高于对照。由图2(b)可知，第2天时H2O2处理组切花SOD活性低于对照，之后开始逐渐升高，第4天达到峰值，之后开始下降，而0.3 mg/L H2O2处理(T6)SOD活性峰值提前1天，第5天T4处理切花SOD活性明显低于对照，达到最低。
图2 不同浓度ASA和H2O2瓶插处理‘凤丹’切花SOD活性变化
2.3 不同浓度ASA和H2 O2对牡丹切花POD活性的影响
由图3(a)可以看出，瓶插前4天各处理切花POD活性变化并不明显，维持在较低状态，第5天显著升高，以2.5、5 mg/L ASA处理组(T1、T2)最为明显。图3(b)显示，0.3 mg/L H2O2处理(T6)切花POD活性第2天时显著升高并达峰值，而后逐渐降低，而对照在第5天时升到最高，高于处理组。
图3 不同浓度ASA和H2 O2瓶插处理‘凤丹’切花POD活性变化
2.4 不同浓度ASA和H2 O2对牡丹切花CAT活性的影响
图4表明ASA和H2O2处理均对切花CAT活性变化有显著影响。由图4(a)可知，处理组切花CAT活性变化均较对照平稳，其中5 mg/L ASA处理(T2)切花CAT活性第2天升至最高，之后开始下降，第4天降至最低但仍高于对照。由图4(b)可知，对照切花CAT活性先升高再降低，0.003 mg/L H2O2处理(T4)CAT活性峰值延后，其余浓度H2O2处理下CAT活性变化趋势较稳定，基本呈现先升高再降低趋势，且在第5天均低于对照。
图4 不同浓度ASA和H2O2瓶插处理‘凤丹’切花CAT活性变化
2.5 不同浓度ASA和H2 O2对牡丹切花MDA含量的影响
由图5(a)可知，ASA处理切花花瓣内MDA含量第2天时明显降低，之后开始缓慢上升，第4天花朵完全盛开时MDA含量均低于对照。这说明ASA能有效缓解‘凤丹’花瓣细胞的膜质过氧化程度，且T3处理MDA含量最低，即10 mg/L ASA对切花保鲜效果最好。图5(b)显示，第4天时切花花瓣细胞膜受到严重伤害，0.003、0.03 mg/L H2O2处理(T4、T5)下MDA含量的升高得到抑制，可有效缓解这种伤害；
但T6处理MDA含量高于对照，这可能是由于过高浓度的H2O2对花瓣细胞膜造成损伤所致。
图5 不同浓度ASA和H2O2瓶插处理‘凤丹’切花MDA含量变化
2.6 不同浓度ASA和H2O2对牡丹切花细胞核变化的影响
细胞核内部的DNA和染色体与DAPI结合后会在紫外光下发出强烈的蓝色荧光，正常的植物细胞核形态表现为规整的圆形或者椭圆形(图6-T7-1)。逆境胁迫下，为了满足生理代谢所需的营养物质，细胞核会放大甚至变形来加强细胞吸收物质的能力[23]。因此细胞核的形态变化可以作为检验植物细胞衰老的指标之一。
由图6可知，瓶插第2天，对照切花有少数细胞核出现变形，细胞核向两极拉伸，逐渐变为纺锤状或新月状(图6-T7-2)，这是由核内染色质凝缩向核边缘聚集所致。第2天、第3天，变形的细胞核数目逐渐增多。从第4天开始，显微镜视野下细胞核发出的荧光强度开始减弱、细胞核变小、大面积的细胞核发生固缩现象而紧贴在细胞边缘，推测这是由染色质凝缩聚集、液泡膜破裂挤压细胞核所致。第5天，显微镜下的荧光信号进一步减弱，细胞核凝缩至最小，染色质分散在细胞核边缘发出微弱荧光。
T1～T3处理(图6)为‘凤丹’切花瓶插于不同浓度ASA中的细胞核变化情况:瓶插初期，与对照相比其细胞核的变形数目差异并不明显，仅有部分细胞核发生拉长弥散现象；
瓶插后期，2.5、5 mg/L ASA处理下细胞核维持高正常率且持续发出荧光的时间较对照久，直到第5天才出现部分细胞核浓缩现象，且5 mg/L ASA处理细胞核第5天依然保持高亮状态，但10 mg/L ASA处理细胞核第5天已经完全弥散变形。
T4～T6处理(图6)显示:0.3、0.03 mg/L H2O2处理能较好维持‘凤丹’切花细胞和荧光信号，瓶插第5天时大部分细胞核仍然保持规则明亮，以0.03 mg/L H2O2处理的效果最好。
图6 不同瓶插处理‘凤丹’切花花瓣细胞核(×10)变化情况
花朵在脱离植物主体之后，光合作用和呼吸作用会继续进行，若无法从瓶插液中吸收水分、矿质营养、激素等植物生长必需的营养物质，切花花瓣和花梗就会发生一系列生理生化响应，最终导致细胞衰老和死亡。乙烯和超氧阴离子含量的迅速增加，会加速花瓣的衰老。因此，调节植物生理平衡是延长切花花期的重要因素。牡丹切花衰败期的典型特征是花瓣枯萎、鲜重下降、花径变小。本研究结果表明，ASA处理对切花的盛花期时长有影响，2.5 mg/L ASA促进切花绽放，使其花径迅速达到最大，并在之后保持一段时间。这表明适宜浓度的ASA刺激切花的营养生长。H2O2处理下切花花径增加缓慢，盛花期花朵直径均低于对照，说明H2O2抑制切花的正常生理机制，减缓切花的代谢过程，从而达到长时间保鲜的效果。
正常植物细胞中活性氧的浓度并不高，但当受到逆境胁迫时，植物会加快细胞内的生理活动及代谢过程，产生过量的ROS，这些过量的ROS又对植物本身造成氧化伤害，导致植物逐渐衰老[24，25]。因此，植物的衰老也是一种氧化过程[26]。为了控制活性氧的含量，植物进化出一套与之对抗的抗氧化清除系统，它通过调节相关保护酶的活性和非酶类抗氧化剂含量，来维持生理机制的正常运行。本研究通过对‘凤丹’切花施加外源ASA、H2O2，测定其在瓶插期间的花径大小、MDA含量，观察其细胞核形态变化，以此来判断‘凤丹’衰老程度，再通过检测衰老过程中花瓣保护酶活性的变化，来推测‘凤丹’切花衰老过程中抗氧化清除机制的运作规律。超氧化物歧化酶(SOD)能够催化细胞内歧化生成O2和H2O2，而过量的会造成生物体内的组织损伤，因此SOD是植物细胞重要保护酶，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用。本试验结果表明，施加一定浓度的外源ASA和H2O2后，SOD活性在瓶插第2天显著降低，说明植物细胞内超氧阴离子没有过量增长而刺激SOD产生反应，这可能是由于外源ASA提高ASA和GSH(谷胱甘肽)组成的ASA-GSH循环系统的代谢活动，清除大部分瓶插初期植物细胞产生的活性氧，因此没有触发SOD活性升高；
外源H2O2的刺激作为一种逆境信号分子，激活植物细胞内其它抗氧化酶的活性，例如过氧化物酶和过氧化氢酶，短暂维持细胞正常生理代谢，延迟SOD活性的增强。这与杨庆贺[13]、蒋景龙[18]等的研究结果一致。过高浓度的ASA和H2O2促使SOD活性高于对照或者峰值提前，推测是由于高浓度的外源处理对切花产生胁迫作用，ROS水平急剧增加，继而细胞产生过氧化应激反应，致使SOD活性迅速升高。
过氧化物酶(POD)是氧化还原酶的一种，在植物体中大量存在，且活性在植物生长发育过程中不断发生变化。有研究表明，POD在生物体老化组织中活性较高，因此这种酶可以作为植物组织老化的标志性酶。本试验发现，外源ASA处理前期，POD活性变化不显著；
切花瓶插后期2.5、5 mg/L ASA处理下，POD活性升高，且都较对照高。这说明瓶插后期切花花瓣细胞开始受到活性氧的胁迫，为了抵御这种胁迫，植物自身激发POD活性上升，来清除过多的自由基，而适宜浓度的ASA可以维持这种平衡。外源H2O2处理下，细胞内POD活性整体出现类似的变化趋势，但在0.3 mg/L H2O2处理下，POD活性在第2天出现急剧上升，之后下降并持续保持在较低水平。这是因为过高浓度的H2O2从一开始就对切花产生逆境胁迫，短暂触发抗氧化酶活性，POD活性急剧升高。在植物抗氧化系统感知高浓度的H2O2影响超出植物自身的修复能力之后，POD随即逐渐失去活性。
过氧化氢酶(CAT)能够清除植物细胞内的过氧化氢，把其分解成H2O和O2，使植物免受H2O2的伤害，通常与SOD协同作用。本试验结果表明，瓶插期间‘凤丹’切花CAT活性出现明显变化，瓶插前期出现较大增幅，而适宜浓度的外源ASA、H2O2处理下，相较于对照，这种增长趋势被减缓或者推迟。这可能是外源ASA和H2O2协同影响‘凤丹’切花细胞内的ROS含量，从而导致花瓣细胞内CAT活性趋于稳定。这与苏军等[27]关于小苍兰的研究结果一致。但如何缓解氧自由基引起的伤害以及延长牡丹切花瓶插时间的最合适浓度，还有待进一步研究。
正常状态下完整细胞核数量与花朵的生长状态呈正相关，细胞核完整性越高，花瓣细胞排列越整齐一致。正常细胞核边缘清晰，呈现标准的圆形，当受到外界环境胁迫时，细胞核产生应激反应变形延伸，导致液泡膜破裂、细胞液将细胞核挤压至边缘，此时细胞核呈现向两极拉伸状、紧贴细胞壁[32]。本试验采用形态学观察法，利用DAPI与细胞核中DNA特异性结合发出的蓝色荧光来观测细胞核形态，结果显示:对照‘凤丹’切花细胞核形态呈规律性变化，瓶插后期逐渐固缩变形直至核膜破裂、核质流失；
而适宜浓度的ASA、H2O2处理下‘凤丹’切花瓶插期间细胞核发生变形的时间被延迟，细胞核更加持久地维持规则明亮状态，其中浓度5 mg/L ASA和0.03 mg/L H2O2效果最为显著，而ASA、H2O2浓度过大或过小都有可能使花瓣受到胁迫导致细胞核浓缩或者出现弥散情况。
本试验关于牡丹切花瓶插寿命的研究发现:辅以外源化学物质调控，切花花瓣在衰老过程中其生理指标与细胞核形态指标虽然都存在变化，但是发生的重要程度、发生时期与时间顺序不完全吻合。外源ASA处理下CAT活性峰值出现最早，其次为SOD、POD。在其它作物研究中，保护酶活性的变化规律分别有不同的报道[33，34]，这可能是因为不同植物其应对逆境胁迫的响应机制和发挥作用的途径不同，也可能是内部调控基因的差异所造成。通过对切花生理学及细胞学的研究观察，结合‘凤丹’花径的变化规律，得出初步结论:5 mg/L ASA和0.03 mg/L H2O2处理能有效维持切花细胞抗氧化酶清除系统的平衡，减轻活性氧对细胞膜的破坏作用；
外源ASA、H2O2对‘凤丹’切花具有保鲜作用的细胞学机制在于缓解花瓣细胞核弥散程度，维持细胞核形态。本研究结果可为进一步揭示外源ASA、H2O2对牡丹切花保鲜时间的延长提供试验依据，为未来研究牡丹切花衰老机制提供理论参考。
另外，关于外源ASA、H2O2对牡丹切花生理生化活性及细胞学特性的具体影响机制还待进一步研究；
牡丹切花细胞程序性死亡相关各类事件的重要程度、发生的顺序和互相作用机制也许能为牡丹切花保鲜研究提供新的思路；
细胞核变形弥散情况或将成为一种新的判断植物衰老的可行性指标。
作者贡献:邱永杰是本研究的试验设计者和试验执行人，完成论文初稿写作；
何松林是项目的构思者及负责人；
胡缓参与协助了实验操作过程；
张翔宇、于嘉伦和史来琨完成数据整理与分析；
贾文庆指导试验设计、数据分析、论文写作与修改。
