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关文碧 ，杨晓静，郑嵋丹，朱国榕
1. 肇庆学院食品与制药工程学院（肇庆 526061）；
2. 农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（肇庆）（肇庆 526061）
在我国环境激素类农药优先名录中[1]，三唑醇是除活体试验以外的试验数据证明具有内分泌干扰作用的农药，吡虫啉、腈菌唑、丙环唑和戊唑醇是美国环保局经4个暴露途径筛选出的农药品种。2018年珠江流域监测显示吡虫啉的检出率为98.6%，最大检出质量浓度为162 ng/L[2]。2019年江苏太湖水样监测显示[3]，戊唑醇检出率为97%，最高检出质量浓度为2 040 ng/L；
三唑醇检出率为100%，质量浓度为11～15 ng/L。2020～2021年间河北白洋淀中丙环唑的监测质量浓度为3.84～1 209 ng/L[4]。沈阳污水处理厂的进水和出水中均检出腈菌唑，质量浓度在1.5～5 μg/L范围内[5]。为保护人类健康，美国规定鱼、软体动物中吡虫啉的限量值为50 μg/kg[6]，日本规定上述5种农药在水产品中执行0.01 mg/kg的限量标准[7]。而我国尚未对水产品中腈菌唑、丙环唑、三唑醇、戊唑醇和吡虫啉制定最大残留限量要求。
试验选择高选择性、高灵敏度的液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技术，基于高效、价廉的分散固相萃取法，建立LC-MS/MS快速检测水产品中5种环境激素类农药的残留分析方法，并在广东省内采集市售60份鱼、虾和螺样品进行检测，为水产品中环境激素类农药残留风险评估和风险预警提供数据支持。
1.1 材料与仪器
腈菌唑标准溶液100 mg/L、丙环唑标准溶液100 mg/L、三唑醇标准溶液100 mg/L、吡虫啉标准溶液1 000 mg/L（阿尔塔科技有限公司）；
戊唑醇标准溶液100 mg/L（北京海岸鸿蒙标准物质技术公司）；
甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、乙酸乙酯（分析纯）、甲酸（分析纯）、乙酸（分析纯）：上海安谱实验科技股份有限公司；
氯化钠、无水硫酸钠（均为分析纯，西陇科学股份有限公司）；
PSA固相萃取填料、C18固相萃取填料（直径40～60 μm，天津博纳艾杰尔科技有限公司）；
γ相纳米氧化铝（直径10 nm，南京先丰纳米材料科技有限公司）；
弗罗里硅土（0.075 0～0.150 mm孔径，即100～200目）、中性氧化铝（0.048 0～0.075 0 mm孔径，即200～300目）：上海阿拉丁生化科技有限公司。
Waters Xevo TQD液相色谱质谱联用仪（美国Waters公司）；
Centrisartg-16C高速冷冻离心机、Secura®分析天平（德国Sartorius公司）；
Multi Reax全能型振荡器（德国Heidolph海道夫）；
Thermo μV-TOC超纯水系统（美国Thermo公司）；
KQ-25ODE数控超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 溶液配制
分别量取1.0 mL腈菌唑/丙环唑/戊唑醇/三唑醇标准溶液（100 mg/L）和100 μL吡虫啉标准溶液（1 000 mg/L）于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配得10 mg/L 5种农药的混合标准溶液。量取1 mL甲酸和1 mL乙酸分别加入100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度线，摇匀，配得1.0%甲酸乙腈和1.0%乙酸乙腈。
1.2.2 样品前处理
分别取虾、鱼、贝可食用部分，用高速搅拌机充分搅碎后置于-18 ℃冰箱中避光保存，使用前常温解冻。称取2 g鱼、虾及贝类样品于50 mL塑料离心管中，加入10 mL乙腈，振荡提取20 min，加入2 g氯化钠和2 g无水硫酸钠，涡旋30 s，在4 000 r/min转速下离心5 min，取上清液过0.22 μm有机滤膜，待测。
1.2.3 色谱条件
1.2.3.1 HPLC条件
色谱柱ACQUITU UPLC® HSS T3（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；
柱温25 ℃；
流速0.3 mL/min；
进样量5.0 μL；
流动相为0.1%甲酸水溶液和乙腈；
洗脱方式采用梯度洗脱。洗脱程序：0～1.0 min，乙腈由10%上升至90%，1.0～3.0 min，乙腈保持90%，3.0～3.5 min，乙腈下降至10%，3.5～5 min乙腈保持10%。
1.2.3.2 质谱条件
离子化模式ESI+；
质谱扫描方式采用多反应监测；
干燥气流量600 ℃；
干燥温度200 ℃；
离子传输管温度500 ℃；
5种农药的质谱参数见表1。
表1 5种农药的质谱参数
2.1 样品前处理方法的优化
2.1.1 提取溶剂的优化
试验以虾作为基质，选择甲醇、乙腈、乙酸乙酯、1%甲酸乙腈和1%乙酸乙腈5种溶剂做加标回收试验，对提取溶剂的种类进行优化，结果如图1所示。用乙腈提取5种农药添加回收率相对较高，目标物回收率在75%～95%，因此使用乙腈作为提取剂。
图1 提取溶剂对虾中农药回收率的影响
2.1.2 提取方法优化
不同提取方式对样品的提取效果具有一定差异，选取虾作为样品基质，比较振荡提取20 min和超声提取20 min这2种提取方式下目标物的添加回收率，结果见图2。振荡提取的目标物回收率比超声提取目标物回收率高，因此，试验选择振荡提取方式。
图2 提取方式对虾中农药回收率的影响
2.1.3 盐析条件的优化
试验对比“2 g氯化钠+2 g无水硫酸钠”和“2 g氯化钠+2 g无水硫酸镁”的盐析效果。使用“2 g氯化钠+2 g无水硫酸钠”作为盐析剂，5种农药回收率为75.7%～91.8%，SRSD为3.38%～7.59%。使用“2 g氯化钠+2 g无水硫酸镁”作为盐析剂，5种农药回收率为69.3%～114.2%，CV为4.11%～11.21%。所以试验选用“2 g氯化钠+2 g无水硫酸钠”作为盐析剂。
2.1.4 净化条件的优化
试验分别以50 mg PSA、50 mg C18、50 mg 10 nm氧化铝、50 mg弗罗里硅土和50 mg中性氧化铝作为净化剂，以及不加净化剂6个条件进行净化效果的对比。不同净化条件下虾中农药添加回收试验结果如图3所示。使用等量的PSA、C18、纳米氧化铝、弗罗里硅土和中性氧化铝时，吡虫啉添加回收率分别为67.1%，61.3%，66.6%，59.4%和66.7%。不使用净化剂时，吡虫啉回收率为78.2%。净化剂的使用会导致吡虫啉的添加回收率下降。同时，使用C18作为净化剂会使丙环唑和戊唑醇下降到66.4%和69.6%。此外，对比不同净化条件下目标物的基质效应。基于1.2.2的样品前处理方法，分别以50 mg PSA、50 mg 10 nm氧化铝、50 mg弗罗里硅土和50 mg中性氧化铝作为净化剂对1 mL空白虾样品提取溶液进行净化及不加净化剂净化，得到不同净化条件下虾的空白样品溶液，用以稀释10 mg/L的5种农药的混合标准溶液，配制5.0～200 μg/L的基质标准溶液和溶剂标准溶液。按照式（1）计算农药的基质效应，结果如表2所示。无净化和加入不同净化剂对目标农药的基质效应影响不大。因此，在满足回收率的要求并兼顾节省经济成本、简化提取步骤的前提下，试验选择省略添加净化剂步骤，样品经提取、盐析、离心后过膜直接供LC-MS/MS检测分析。
图3 不同净化条件对虾中农药回收率的影响
表2 不同净化条件对农药的基质效应的影响
2.2 分析方法的确证
2.2.1 溶剂标准曲线、基质标准曲线和基质效应
按照1.2.2的样品前处理方法制得鱼、虾、白螺的空白样品溶液，分别以空白样品溶液和甲醇稀释10 mg/L的5种农药的混合标准溶液，配得质量浓度1.0，2.0，5.0，10，20，50，100和200 μg/L的基质标准溶液和溶剂标准溶液。采用LC-MS/MS检测，以进样浓度为横坐标，农药峰面积为纵坐标，分别绘制基质标准曲线和溶剂标准曲线，结果表明，鱼、虾、螺样品基质中和纯甲醇溶剂中5种农药在1～200 μg/L的质量浓度范围内均有良好的线性关系，基质标准曲线和溶剂标准曲线的相关系数（r）均在0.999 2～0.999 9范围内。
按照式（1）计算农药的基质效应，结果如表3所示。
表3 5种农药的基质效应
当基质为虾时，腈菌唑、丙环唑、戊唑醇无明显的基质效应，三唑醇有明显增强的基质效应，吡虫啉有明显减弱的基质效应；
当基质为鱼时，腈菌唑无明显基质效应，丙环唑、戊唑醇和三唑醇表现为明显减弱的基质效应，吡虫啉为明显增强的基质效应；
当基质为白螺时，除三唑醇没有明显的基质效应外，其余4种均有明显减弱的基质效应。
2.2.2 准确度和精密度
接表4
为验证试验方法的准确度和精密度，在虾、鱼、白螺3种水产品中进行5，20和50 μg/kg 3个质量分数下的添加回收率试验，所得平均添加回收率和变异系数如表4所示。结果表明，5种农药的平均添加回收率为70.55%～107.34%，C.V.为0.73%～10.35%，符合农药残留分析的要求。
表4 虾、鱼和白螺中5种农药的平均添加回收率和相对标准偏差（n=6）
2.2.3 检出限和定量限
按照3倍信噪比判断检出限，10倍信噪比判断定量限，分别得到5种农药的检出限为1 μg/kg、定量限为5 μg/kg。
2.2.4 实际样品测定
为检验试验方法的可行性和实用性，从广东湛江市场中随机采购鱼、虾、螺各20个样品进行检测，图4为质量浓度20 μg/L的虾基质标准溶液和虾的实际样品的总离子流图。60个鱼、虾、螺样品均未检出腈菌唑、丙环唑、戊唑醇、三唑醇和吡虫啉5种农药。
图4 质量浓度20 μg/L的虾基质标准溶液的总离子流图（A）及虾实际样品的总离子流图（B）
试验通过对提取溶剂、提取方式、盐析条件、净化条件等进行优化，建立LC-MS/MS快速检测水产品中的腈菌唑、丙环唑、戊唑醇、三唑醇和吡虫啉的残留分析方法。试验方法灵敏度高、可靠性和实用性良好，可作为水产品中农药残留快速定量分析的一种新方法。
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