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张钰滢 ，曾志君 ，陈会超 ，张小斌 ，杨朝军 ，戴 洁 ，董莉娟 ，张琬悦 ，马艳玲 ，陈 敏
（1）昆明医科大学公共卫生学院，云南 昆明 650500;2）云南省疾病预防控制中心性病艾滋病防制所，云南 昆明 650022）
WHO 估计2020 年全球4 种性传播感染（梅毒、淋病、CT 和滴虫感染）新发病例共3.74 亿人，其中CT 感染者为1.29 亿，较2016 年增长1.4%[1]。在中国105 个国家级性病监测点中，生殖道沙眼衣原体的感染率从2015 年的37.18/10 万增长到2019 年的55.32/10 万，年均增长10.44%[2]。就云南省而言，2012～2017 年生殖道沙眼衣原体感染报告发病数年均增长率为26.15%，报告发病率年均增长率为25.35%，并且比数图法结果显示生殖道沙眼衣原体感染在云南省有流行的趋势[3]。沙眼衣原体分型是了解其感染流行病学特征的重要技术手段。毒株分型对确定毒株的器官/组织嗜性；
鉴定和区分新感染、持续感染和再感染；
了解性网络伴侣中的传播动态以及对特定克隆的进化监测具有重要意义。为进一步遏制云南省CT的传播，本研究针对暗娼人群展开了CT 基因型的分子流行病学调查。
1.1 研究对象
资料来源按照《云南省淋病及生殖道沙眼衣原体感染专题调查工作方案》，在全省16 个州（市）各抽取1 个艾滋病监测哨点，同时开展淋病及生殖道沙眼衣原体感染情况的调查，每个点样本量为200，调查对象为目前从事商业性性交易的妇女，样本要求来源于社区（必须覆盖街头流动暗娼和乡镇暗娼），根据当地暗娼危险行为状况，可将发生高危行为的场所分为高、中、低3 个层次。低等层次场所的暗娼不得低于调查样本量的10%，中等层次场所的暗娼不低于40%，并按要求采集尿液样本，调查对象签署知情同意书。最终收集调查对象中CT 核酸检测为阳性的样本374 例，进行CT 的基因型检测，本研究通过云南省生物医学伦理审查委员会批准。
1.2 方法
1.2.1 流行病学资料收集整合艾滋病哨点监测工作，按照《云南省艾滋病哨点监测方案》中规定的方法，采用一对一问卷调查，填写《暗娼健康调查问卷》开展问卷调查，问卷内容主要包括一般人口学信息、性病艾滋病防治知识、毒品使用和性行为发生情况等。
1.2.2 序列扩增和测定使用巢式PCR 扩增CT的ompA基因，参考文献[4]后优化了扩增引物。第1 轮PCR 使用Ex Taq（Takara，大连，中国），其中核酸体积10 µL，PCR 反应体系25 µL，引物为36F（5′-CGCTTTGAGTTCTGCTTCCTCCTT-3′）和1185R（5′-GCGGAATTGTGCATTTACGTGAGC-3′），扩增产物1150 bp。第2 轮PCR 使用2×Taq PCR MasterMix（Tiangen，北京，中国），其中第1 轮扩增产物5 µl，PCR 反应体系50 µL，引物为87F（5′-TGAACCAAGCCTTATGATCGACGG-3′）和 1091R（5′ -ACTGCAATACCGCAAGATTTTCTAGATTTC-3′），扩增产物1 005 bp。两轮PCR 反应条件均为：94 ℃预变性3 min；
94 ℃变性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸70 s，40 个循环；
72 ℃延伸10 min。经琼脂糖凝胶电泳鉴定为扩增成功的样品送北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序，使用第2 轮扩增引物进行双向测序。
1.2.3 测序结果分析测序结果用Sequencher5.1软件进行序列拼接，拼接结果使用BioEdit7.0 软件进行比对。通过使用美国国立生物技术信息中心（www.ncbi.nlm.nih.gov）的BLAST 比对确定CT 的基因型。
1.3 统计学处理
2.1 样本的人口学特征
在收集到的CT 核酸检测为阳性的374 个样本中，173 个样本扩增测序成功，见表1，获得序列的173 个样本和总的374 个阳性样本在年龄分组、样本来源、场所类别等特征上没有统计学差异。
表1 获得分型和收集到的研究对象的构成[n（%）]Tab.1 Obtained typing and composition of the collected study subjects [n（%）]
在173 个样本中，感染者的平均年龄为（26.8±9.7）岁；
云南省户籍占87.9%；
汉族占57.2%；
未婚占57.2%；
初中学历占53.2%；
研究对象主要来自滇西北（48.0%）和滇南地区（34.1%），见表2。
表2 不同亚型感染者的人口学特征[n（%）]Tab.2 Demographic characteristics of patients with different subtypes of infection [n（%）]
2.2 CT 基因型分布特征
在173 份样本中共检测到7 种基因型，其中以E 型、F 型、J 型和D 型为主要基因型，分别占24.9%、21.4%、19.1%、17.9%，其他亚型包括G 型（9.6%）、K 型（4.6%）和H 型（2.9%）。CT基因型在主要人口学特征上差异无统计学意义（P>0.05）。
本研究依托艾滋病哨点监测平台在云南省开展暗娼人群生殖道沙眼衣原体基因型调查，涵盖了不同类型和档次的暗娼人群。暗娼是艾滋病和性病防治的重点人群，且该人群总体受教育程度不高，同时呈现出年轻化的特征，在本次调查中研究对象教育程度以初中及以下、25 岁以下和未婚为主，这与以往的调查结果相一致[5−6]。相关的调查也显示，暗娼人群年龄≤25 岁、未接受过健康咨询服务是CT 感染的危险因素[7]，因此需要进一步依托艾滋病的防治加强暗娼人群的性病预防干预和宣传教育。
CT 主要分为15 种血清型，其不同型别与不同疾病相关，A 至C 型与沙眼有关，D 至K 型与泌尿生殖系统感染有关，L1 至L3 型与系统性性病淋巴肉芽肿（lymphogranuloma venereum，LGV）有关。CT 的基因型分布具有一定的地区差异，如印度以D（48.4%）、E（32.8%）、F（7.8%）和I（9.4%）为主[8]；
奥地利地区以E（50.1%）、F（16.2%）、D/Da（9.7%）和G/Ga（9.0%）为主[9]；
日本以F（32%）、E（17%）为主[10]。我国的一项调查显示前四位 的基因型为F（25.6%），E（17.1%），J（16.3%）和D（15.5%），但不同省份间也存在差异[11]。此外，CT 的基因型也存在一定的人群分布特征。在我国广西和天津的一项调查中表明，性病门诊的女性患者其主要流行基因型为E（29.9%），J（19.7%）和 D（15.3%）[12]。一项在深圳、南京和武汉开展的研究显示，MSM 中CT 以D 和G 型为主，但D 型和G 型分别是南京和武汉首要的基因型[4]。本次调查发现云南省暗娼人群的CT 以E（24.9%）、F（21.4%）、J（19.1%）和D 型（17.9%）为主要基因型，显示了差异化的流行特征，为进一步了解本地CT 的流行趋势需要开展进一步的分子流行学研究。
本调查使用OmpA基因进行分型，这是CT分型的传统方法，但使用单一的基因存在一定的局限性，不能对传播的关联性进行分析。近年来多位点可变数目串联重复分析（Multiple Locus Variable-number tandem repeat Analysis，MLVA）和多位点序列分型（Multilocus Sequence Typing，MLST）常被用于CT 的基因分析，相比OmpA分型方法，这些方法的区分能力更强[13]，可更加精细地用于CT 传播的溯源。今后，可以尝试使用这些方法，加强对CT 传播风险的分析，有针对性地实施干预。
本研究首次在云南省暗娼人群中开展了CT分子流行病学调查，提供了该人群中CT 亚型的基本特征，由于该人群具有隐蔽性，同时在性传播疾病中起着关键性作用，本研究的结果可为进一步控制CT 的传播提供指导，也可为将来治疗和疫苗研究提供基础信息。
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