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宁唤唤 任瑞 康健 白鹭 路延之 谢燕玲 张芳琳 柏银兰
1.空军军医大学基础医学院微生物与病原生物学教研室，陕西西安 710032；
2.延安大学生命科学学院，陕西延安 716000
结核病（tuberculosis，TB）是一种严重的传染病，其病原体是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）[1]。结核菌素皮肤试验是临床诊断Mtb 感染的主要方法[2]，该方法采用结核菌素纯蛋白衍生物为刺激抗原，其不能区分卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin，BCG）接种、非结核分枝杆菌和Mtb 感染[3]。因此，开发快速、特异且敏感的诊断方法对于控制TB 流行十分重要。
BCG 是牛分枝杆菌经传代获得的减毒株，在传代中缺失了16 个基因差异区（region of difference，RD）[4]。RD1 区是BCG 减毒过程中最早丢失的。6 kD 早期分泌靶抗原（6 kD early secretory antigenic target，ESAT-6）由Rv3875（esxA）基因编码，该基因位于Mtb RD1 区，在BCG 及绝大多数非结核分枝杆菌中不存在[5]。培养滤液蛋白10（culture filtrate protein，CFP-10）是由RD1区Rv3874 基因编码的分泌抗原，通常与ESAT-6 形成异源二聚体[6]。γ-干扰素释放试验（interferon-gamma release assay，IGRA）是体外诊断TB 的免疫学方法，该方法是基于Mtb 感染致敏的ESAT-6 和CFP-10 特异性T 细胞，IGRA 诊断活动性TB 的敏感性和特异性高于结核菌素皮肤试验[7]。目前市售的ESAT-6 单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）由Abcam 公司生产（11G4，ab26246）。本研究以重组ESAT-6 蛋白免疫小鼠，制备抗ESAT-6 的mAb，为诊断Mtb 感染、研发抗感染疫苗及药物奠定了基础。
1.1 菌株与实验动物
大肠埃希菌（Escherichia coli，E.coli）BL21、DH5α、小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0、E.coli BL21 pET-28a（+）-ESAT-6[8]为课题组保存。Mtb H37Rv、Mtb H37Ra、BCG、耻垢分枝杆菌、肺炎链球菌和E.coli 菌体蛋白为前期制备。8 只6～8 周龄SPF 级雌性BALB/c 小鼠由空军军医大学实验动物中心提供，使用许可证号：SYXK（陕）2019-001，生产许可证号：SCXK（陕）2019-001。小鼠饲养温度为（20±1）℃，湿度为50%，饮用无菌水并喂养普通饲料。本研究经空军军医大学第二附属医院伦理委员会批准（TDLL-2016325）。
1.2 主要仪器与试剂
Ni sepharose 组氨酸标签蛋白纯化亲和层析填料（GE，17-5268-01）；
多功能酶标仪（BioTek，Synergy2）。RPMI1640 培养基（Hyclone，SH30027.01）；
胎牛血清（浙江天杭生物公司，13011-8611）。小鼠IgG 亚类检测试剂盒（Frdbio，FRD90100K8）；
6×His mAb（Abcam，ab18184）。
1.3 重组ESAT-6 蛋白纯化
将E.coli BL21 pET-28a（+）-ESAT-6[8]扩大培养并收集菌体。菌体裂解液与Ni2+柱结合后弃上清，洗涤3 次后，洗脱目的蛋白。收集洗脱液电泳分析、定量分析目的蛋白。
1.4 ESAT-6 mAb 制备及纯化
以重组ESAT-6 蛋白经皮下免疫BALB/c 雌性小鼠，分离ESAT-6 蛋白皮下免疫小鼠的脾细胞，与骨髓瘤细胞SP2/0 融合，培养至出现细胞克隆，收集培养上清。酶联免疫吸附试验法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）分析细胞上清液中的抗体含量。选择阳性克隆并筛选可持续分泌mAb 的杂交瘤细胞系，制备腹水。采用液相色谱法纯化腹水中mAb[9]。
1.5 检测ESAT-6 mAb 亚类及相对亲和力
以ESAT-6 包被酶标板，依次加入100～51 200 倍（二倍梯度稀释）的抗体孵育。二抗显色后记录吸光度OD450值。绘制曲线时以抗体稀释度的倒数为横坐标，OD450值为纵坐标，取曲线最高值50%时稀释度的倒数为该mAb 的相对亲和力。
1.6 检测ESAT-6 mAb 特异性
分别将纯化的ESAT-6 蛋白及各菌体蛋白上样并进行蛋白电泳，转膜、封闭后，以ESAT-6 mAb、6×His mAb 和Mtb 感染小鼠多抗血清为一抗，蛋白印迹法分析mAb 的特异性。
2.1 重组ESAT-6 蛋白纯化结果
纯化的ESAT-6 分子量约为10 kD，与理论分子量一致。收集洗脱液并透析目的蛋白，蛋白定量浓度为1.5 μg/μl。见图1。
图1 亲和层析纯化ESAT-6 蛋白
2.2 ESAT-6 mAb 制备、鉴定及纯化结果
经过ELISA 筛选后，将可持续分泌mAb 的杂交瘤细胞株扩大培养，制备腹水并纯化mAb。mAb 的重链和轻链分子量分别约为50、25 kD，且mAb 可与重组的ESAT-6 特异性结合，His mAb 和Mtb 多抗血清为对照。见图2。
图2 ESAT-6 单克隆抗体制备及鉴定
2.3 ESAT-6 mAb 亚类及相对亲和力分析结果
ESAT-6 mAb 为IgG1 亚类，见图3。相对亲和力检测的吸光度曲线上升至趋于平坦时OD450值为0.696，记作100%，该吸光度50%时的稀释度为25 600，故mAb 的相对亲和力为3.9×10-5。见图4。
图3 ESAT-6 单克隆抗体亚类分析
图4 ESAT-6 单克隆抗体的相对亲和力分析
2.4 ESAT-6 mAb 特异性分析结果
不同细菌的菌体蛋白条带分布均匀，蛋白浓度相近。纯化ESAT-6 mAb 可特异识别Mtb 标准毒株H37Rv 中ESAT-6 蛋白，但不识别H37Ra 和耻垢分枝杆菌的同源蛋白，且不与BCG、肺炎链球菌、大肠埃希菌的裂解物非特异性反应。见图5。
图5 ESAT-6 mAb 对不同菌体蛋白的识别
Mtb 感染机体后，刺激机体产生多种致敏T 细胞，分离这些细胞在体外培养，当其受到相同的抗原二次刺激时，能够分泌大量的抗原特异性γ 干扰素，这种基于抗原特异性γ 干扰素释放水平的IGRA 可判断是否感染Mtb[7,10]。对Mtb 未感染人群分析后，其IGRA 结果为阴性；
而对包括结核菌素皮肤试验阳性的TB 密切接触者、淋巴结核患者、痰菌阴/阳性的肺结核患者人群分析后，其IGRA 结果均为阳性[11]。ESAT-6联合CFP-10、肝素结合血凝素等抗原可提高TB 诊断敏感性[12-13]。说明ESAT-6 抗原在诊断Mtb 感染中特异性良好。
基于ESAT-6、CFP-10 mAb 的胶体金免疫层析法，对包括痰、血浆、胸腔积液等在内的临床样本检测敏感性高、特异性强，但对血浆或胸腔积液样品中Mtb 检测不敏感[14]。ESAT-6 mAb 为捕获抗体的无标记电化学免疫传感器，可检测不同Mtb 致病菌株培养滤液中的天然ESAT-6[15]，该方法对纯化蛋白的检测下限可达10-12g/ml[16-17]。宿主细胞内的ESAT-6 与机体内有活性的Mtb 直接相关[18]。课题组证实TB 患者血清中ESAT-6 特异性抗体水平较健康人群升高[19]。对Mtb 感染患者，采用ESAT-6 mAb 标记患者细胞内Mtb 分泌的ESAT-6，发现TB 患者细胞内ESAT-6阳性率高达90%[18]，该方法诊断Mtb 感染不易受到机体免疫功能的影响。表明ESAT-6 mAb 在TB 诊断中具有较好的应用潜能。
Mtb Erdman、CDC1551 和HN878 株的毒力高于H37Rv株[20]，且前3 种毒性更高菌株的ESAT-6 水平均高于H37Rv[21]。经过对Mtb 减毒株H37Ra 与标准毒株H37Rv 的ESAT-6 氨基酸序列分析，发现两种菌株中ESAT-6 氨基酸序列一致，本研究中ESAT-6 mAb可特异性识别H37Rv，而与H37Ra 减毒株无反应，提示ESAT-6 在减毒株中H37Ra 中的表达量较低甚至不表达，因此未能检出。耻垢分枝杆菌中ESAT-6 同源蛋白与Mtb 的相似性为72%[22]，而牛分枝杆菌减毒活疫苗BCG、肺炎链球菌及大肠埃希菌中均不编码ESAT-6 蛋白，ESAT-6 mAb 与这几种细菌蛋白无反应。国内多位研究者也制备了ESAT-6 mAb[23-25]。由于其他团队抗体不可获得，因此无法将本研究制备ESAT-6 mAb 与其他抗体敏感性和特异性比较。综上所述，本研究制备的ESAT-6 mAb 特异性识别Mtb毒株，可用于Mtb 感染诊断及致病机制的研究。
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