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黄宇，李响，胡旭
膀胱癌是产生于膀胱壁上皮组织和间质组织的恶性肿瘤，临床特征主要表现为肉眼可见的间歇性血尿、肾积水、膀胱刺激症(尿痛、尿频、尿急)等，严重危害人们生命健康[1-2]。目前临床上非肌层浸润性膀胱癌患者通过尿道膀胱肿瘤切除手术治疗预后良好，但肌层浸润性且发生远处转移的膀胱癌患者经手术治疗后效果不理想，预后较差，有45%～80%的患者出现复发，再次就诊时已严重扩散，患者3年内生存率仍没有得到很大提高[3-4]。因此，寻找与膀胱癌有关的靶基因并深入探索其发病机制，对提高患者生存率具有重要意义。成髓细胞瘤转录因子第2亚型(MYB proto-oncogene like 2，MYBL2)是癌基因编码转录因子，在细胞增殖、生长、分化等过程中起重要作用[5]。研究表明，MYBL2参与肾细胞癌、胃癌、肺癌等多种癌症的发生发展过程[6-8]。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一类非编码小分子RNA，在细胞生长、分化、增殖等过程中具有极其重要的作用，可调控多种mRNA的表达，其在许多癌症疾病中具有早期诊断和准确评估预后情况的巨大潜力[9-10]。miR-631作为一种miRNA，在卵巢上皮性癌等肿瘤中起重要作用[11]。但是MYBL2、miR-631二者在膀胱癌中的表达情况及功能尚未可知。因此现研究膀胱癌组织中MYBL2、miR-631表达水平，并分析它们与患者预后的关系，报道如下。
1.1 一般资料 选取2017年1月—2019年5月在四川大学华西医院泌尿外科行手术治疗的膀胱癌患者133例，术中取患者膀胱癌组织和癌旁正常膀胱组织。其中男81例，女52例，年龄41～80(55.34±12.29)岁；
TNM分期[12]：T1～2期81例，T3～4期52例；
肿瘤分化程度：中高分化86例，低分化47例；
发生淋巴结转移55例，无淋巴结转移78例；
病理类型：膀胱尿路上皮癌110例，鳞状细胞癌13例，腺癌10例。纳入标准：(1)符合膀胱癌诊断标准[12]，且经病理学确诊；
(2)首次患膀胱癌；
(3)所有膀胱癌患者在手术前均未进行任何免疫治疗、放化疗或其他辅助治疗；
(4)无肾、肺、心脏等其他重要器官疾病。排除标准：(1)膀胱癌家族遗传史；
(2)长期服用抑制剂或免疫增强剂药物者；
(3)合并其他恶性肿瘤；
(4)存在严重心血管疾病、自身免疫性疾病、血液系统疾病、感染性疾病者；
(5)肝肾功能异常者。本研究经医院伦理委员会批准(审批号LSJD2016-191)，且患者及家属均知情同意并签署知情同意书。
1.2 试剂和仪器 MYBL2 mRNA、β-actin、miR-631、U6由北京赛百盛基因技术有限公司构建；
Trizol试剂、兔抗人MYBL2单克隆抗体(上海钰博生物科技有限公司)；
PCR试剂盒、山羊抗兔二抗(南京新惠通生物科技有限公司)；
PCR基因扩增仪(上海凌仪生物科技有限公司，型号EP1)；
显微镜(东莞市谱标实验器材科技有限公司，型号SPCC-200)。
1.3 检测指标与方法
1.3.1 MYBL2 mRNA、miR-631表达水平检测：采用荧光定量PCR法进行检测，将膀胱癌组织和癌旁正常膀胱组织制成匀浆，提取组织中总RNA，之后反转录为cDNA模板，使用PCR试剂盒对MYBL2 mRNA、miR-631进行扩增。反应条件为95℃ 5 min；
91℃ 19 s、55℃ 21 s、60℃ 22 s，循环31次。MYBL2 mRNA上游引物：5’-CTAGACCGGTTTCTCCTCATTC-3’，下游引物：5’-GCGTGATTGGCGGTCAAAAGAG-3’；
内参β-actin上游引物：5’-CAGGGCGTGATGGTGGGCA-3’，下游引物：5’-GCTGTCAACCGTTCCAGGTCG-3’。miR-631上游引物：5’-TCTGGCTCCGTGTCTTC-3’，下游引物：5’-GAACATGTCTGCGTATCTC-3’；
内参U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。采用2-△△CT法分析MYBL2 mRNA、miR-631的表达水平。
1.3.2 MYBL2表达情况检测：采用免疫组化法检测，标本经石蜡包埋后，制作5 μm的膀胱癌组织和癌旁正常膀胱组织石蜡切片，将其编码并烘干，进行脱蜡、修复抗原等一系列操作后，加入兔抗人MYBL2单克隆抗体(1∶500)作为一抗，4℃过夜，使用磷酸缓冲溶液清洗后加入山羊抗兔二抗25℃孵育1 h，使用二氨基联苯胺(DAB)染色，苏木素轻微复染。使用显微镜高倍视野(×200)下观察切片，PBS代替一抗作为空白对照。染色强度评分：0分(无)、1分(弱，浅黄色)、2分(中等，棕黄色)、3分(强，棕褐色)。阳性细胞百分比评分：0分(0～5%)、1分(6%～25%)、2分(26%～50%)、3分(51%～75%)、4分(76%～100%)。将染色强度评分和阳性细胞百分比评分的乘积作为总计分[13]：0分为阴性(-)，1～5分为弱阳性(+)，6～9分为中度阳性(++)，10～12分为强阳性(+++)，其中，阴性(-)记为MYBL2阴性，弱阳性(+)、中度阳性(++)、强阳性(+++)记为MYBL2阳性。
1.3.3 随访情况：通过电话、医院复查或家访等方式对膀胱癌患者进行3年随访，术后第1天为随访起始日期，术后第1年每3个月医院复查1次，第2、3年每6个月医院复查1次，3年内每2个月通过电话或家访，记录膀胱癌患者生存情况。随访截止日期2022年5月31日，以膀胱癌患者3年内死亡定义为预后不良。
2.1 预后良好组与预后不良组临床资料比较 经过3年随访，患者生存89例(预后良好组)，死亡44例(预后不良组)，无失访病例。预后不良组T3～4期、低分化、有淋巴结转移患者比例显著高于预后良好组(P<0.01)，见表1。
表1 预后良好组与预后不良组膀胱癌患者临床资料比较
2.2 膀胱癌组织和癌旁正常膀胱组织MYBL2 mRNA、miR-631表达水平及MYBL2阳性表达率比较 与癌旁正常膀胱组织比较，膀胱癌组织MYBL2 mRNA表达水平、MYBL2阳性率明显升高，miR-631表达水平明显降低(P<0.01)，见表2、图1。
表2 膀胱癌组织和癌旁正常膀胱组织MYBL2 mRNA、miR-631表达水平及MYBL2阳性率比较
图1 膀胱癌组织MYBL2表达情况(免疫组化染色，×200)
2.3 膀胱癌组织MYBL2与miR-631的相关性分析 生物信息学ENCORI网站显示，MYBL2、miR-631存在结合位点。Spearman相关性分析发现，膀胱癌组织MYBL2与miR-631表达呈负相关(r=-0.424，P<0.001)。
2.4 膀胱癌组织MYBL2、miR-631表达与患者的预后关系 MYBL2阳性组、阴性组3年生存率分别为62.50%(70/112)、90.48%(19/21)，MYBL2阳性组3年生存率低于MYBL2阴性组(χ2=5.052，P=0.025)；
根据膀胱癌组织miR-631表达水平均数(0.71)将患者分为miR-631高表达组56例(≥0.71)，miR-631低表达组77例(<0.71)；
miR-631低表达组、高表达组3年生存率分别为58.44%(45/77)、78.57%(44/56)，miR-631低表达组3年生存率低于miR-631高表达组(χ2=5.934，P=0.015)，见图2。
图2 膀胱癌组织MYBL2、miR-631表达与患者3年内生存的关系
2.5 Logistic回归分析膀胱癌患者预后不良的危险因素 多因素Logistic回归分析表明，TNM分期T3～4期、肿瘤低分化、有淋巴结转移及膀胱癌组织MYBL2阳性、miR-631低表达是影响膀胱癌患者预后不良的危险因素(P<0.01)，见表3。
表3 Logistic回归分析膀胱癌患者预后不良的危险因素
膀胱癌是泌尿外科最常见的恶性肿瘤之一，好发于50岁以上中老年人，我国每年约有7万多例新确诊的患者，且男性患病率高于女性，膀胱癌在我国男性泌尿生殖系统疾病中排名第8位，具有较高的发病率、复发率和病死率，近年来，膀胱癌的患病率、致死率仍逐年上升，且具有趋向年轻化的特点[14-15]。膀胱癌发病初期病情隐匿，一些患者就诊时已经发生了远处转移，治疗后复发和转移是患者预后较差、3年生存率较低的重要原因[16-17]。因此，寻找与膀胱癌有关的合适的预测因子，可为膀胱癌的临床诊治和预后评估提供重要依据。
MYBL2是转录因子MYB家族的成员之一，是高度保守的癌基因编码转录因子，可参与调控细胞周期、细胞增殖分化、细胞生存等多种生理病理过程[18]。卢洪胜等[19]研究结果表明，MYBL2在胃腺癌组织中呈高表达，且MYBL2高表达患者预后不良，提示MYBL2可能在胃癌的发生发展中发挥重要作用。本研究结果表明，膀胱癌组织中MYBL2 mRNA表达水平和MYBL2阳性表达率明显高于癌旁正常膀胱组织，提示MYBL2在膀胱癌的发生中发挥一定作用；
Kaplan-Meier结果显示，MYBL2阳性组3年生存率低于MYBL2阴性组，提示MYBL2高表达患者预后不良；
多因素Logistic回归分析表明，MYBL2阳性是影响膀胱癌患者预后不良的危险因素，提示MYBL2可作为膀胱癌患者预后评估的肿瘤标志物。
大量研究表明，miRNAs在多种恶性肿瘤侵袭转移等过程起着不可忽视的作用，近年来，其在膀胱癌的发生发展中发挥的作用引起了研究者们的极大兴趣[20-21]，例如，miR-137在膀胱癌组织中呈高表达，且其水平随患者病理分级恶性程度的增加而升高，miR-137在膀胱癌的侵袭转移等过程中具有极其重要的作用[22]。郝朝辉等[23]研究结果表明，miR-182-5p在膀胱癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织，miR-182-5p可能具有促进膀胱癌发生的作用。miR-631作为一种miRNAs，在细胞增殖、分化、凋亡等过程具有重要作用，余丹扬等[11]研究结果表明，卵巢上皮性癌患者miR-631表达下调，且miR-631低表达患者预后不良。miR-631在膀胱癌中发挥的作用研究较少，本研究结果表明，膀胱癌组织中miR-631表达水平明显低于癌旁正常膀胱组织，提示miR-631在膀胱癌的发生中发挥一定作用；
Kaplan-Meier结果显示，miR-631低表达组3年生存率低于miR-631高表达组，提示miR-631低表达患者预后不良。多因素Logistic回归分析表明，TNM分期T3～4期、肿瘤低分化、有淋巴结转移、miR-631低表达是影响膀胱癌患者预后不良的危险因素，提示miR-631可作为膀胱癌患者预后评估的肿瘤标志物，且临床上要重点关注T3～4期、肿瘤低分化、淋巴结转移的患者，及时给予患者干预和治疗，以减少不良预后的发生。生物信息学ENCORI网站显示，MYBL2、miR-631存在结合位点，本研究经进一步Spearman分析发现，膀胱癌组织中MYBL2与miR-631表达呈负相关，提示MYBL2、miR-631可能存在某种靶向关系，共同参与膀胱癌的发生进展过程。
综上所述，miR-631可能通过负调控MYBL2的表达参与膀胱癌的发生发展过程，MYBL2阳性、miR-631低表达均与膀胱癌的发生及不良预后有关，检测MYBL2、miR-631水平对膀胱癌的早期防治及预后评估具有重要意义。
利益冲突：所有作者声明无利益冲突
作者贡献声明
黄宇：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；
李响：病例收集，数据整理；
胡旭：统计学分析，论文修改
