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孟继坤 张 楠 吴 浩 张秀清
(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)
铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)又称黑节草，是一种喜阴喜湿的多年生草本植物，属于兰科石斛属，2021年被列为中国药食同源食品之一，含有多糖、多酚、氨基酸、生物碱、维生素等多种活性成分，其中，多糖是铁皮石斛的主要生理活性成分[1]，具有抗氧化[2]、免疫调节[3-4]、抗肿瘤[5]、降血脂和降血糖[6-7]等多种生理活性。
最传统且适用范围最广的多糖提取方法为热水浸提法[8]。目前，为提高铁皮石斛多糖得率及其生物活性，可采用酶[9]、碱液[10]、低共熔溶剂[11]等化学生物方法辅助提取，也可采用超高压[12]、超声波[13]、微波[14]等物理方法，在不引入新物质的前提下促进石斛细胞内多糖溶出。其中，超高压提取法是指常温下将100～1 000 MPa的流体静压力作用于反应体系，使植物细胞内外产生较大的压差，从而促进植物多糖转移至提取溶剂中的方法，具有提取时间短、提取效率高、对有效成分结构破坏小等优点[15-17]。
研究拟以多糖得率为基础评价指标，通过正交试验优化超高压提取铁皮石斛多糖工艺条件，比较传统热水浸提法及超高压提取法对铁皮石斛多糖相对分子量及单糖组成的影响，并分析其体外抗氧化活性，以期为铁皮石斛多糖的产品开发提供依据。
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料与试剂
铁皮石斛：附树方式生长，采自贵州省兴义；
总抗氧化能力试剂盒：南京建成生物工程研究所；
无水乙醇、浓盐酸、浓硫酸、磷酸、苯酚、葡萄糖、硫酸亚铁：化学纯，北京兴津化工厂；
水杨酸：分析纯，西陇化工股份有限公司；
氯化亚铁、Ferrozine溶液、EDTA：分析纯，上海源叶生物科技有限公司；
甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、阿拉伯糖、岩藻糖标准品：纯度≥99%，美国Sigma公司；
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：分析纯，美国Sigma公司。
1.1.2 主要仪器设备
真空包装机：JF-1616型，宁波欧迩有限公司；
超高压系统：FB-110G5型，上海励途超高压设备有限公司；
高效液相色谱仪：Agilent1200型，配有示差检测器和B.03.01色谱工作站，安捷伦科技有限公司；
液相色谱仪：岛津LC-20AD型，日本Shimadzu有限公司；
冷冻干燥机：FD-2A型，北京博医康实验仪器有限公司；
紫外分光光度计：TU-1810PU型，北京普析通用仪器厂。
1.2 方法
1.2.1 铁皮石斛原料预处理 参照《中华人民共和国药典：2020年版》并略有改动[18]。将铁皮石斛于60 ℃烘至恒重，粉碎，过60目筛，备用。
1.2.2 超高压法提取铁皮石斛多糖 准确称取10 g粉末，加入去离子水，抽真空封口，混匀，一定操作压力下进行超高压处理，抽滤，收集提取液。取5 mL提取液用于多糖得率测定，其余溶液旋转蒸发，加入4倍体积无水乙醇，4 ℃过夜醇沉，6 000 r/min离心10 min，收集沉淀烘干，得超高压提取法铁皮石斛粗多糖DOP-p。
1.2.3 热水浸提法提取铁皮石斛多糖 准确称取铁皮石斛粉末0.500 g，加入5 mL去离子水及20 mL无水乙醇。于150 W下超声提取30 min，6 000 r/min离心10 min，收集沉淀。用10 mL 80%乙醇洗涤离心至上清无色，用水将沉淀转移至圆底烧瓶，加入50 mL去离子水，沸水提取120 min。趁热抽滤，旋转蒸发，加入4倍体积无水乙醇过夜醇沉，离心，收集沉淀，烘干，得热水浸提法铁皮石斛粗多糖DOP-w。
1.2.4 多糖得率测定 采用苯酚—硫酸法[19]。以去离子水作空白对照，绘制葡萄糖标准曲线方程为y=8.256 4x-0.007 4，R2=0.999 6。
1.2.5 蛋白质含量测定 采用考马斯亮蓝法[20]。绘制蛋白质标准曲线为y=0.005x+0.009 3，R2=0.999 1。
1.2.6 酶法—化学法联用脱蛋白 参照文献[21]。
1.2.7 多糖相对分子量测定 采用GPC法[22]。绘制标准葡聚糖曲线方程为lgMw=-1.098 4t+13.66。
1.2.8 单糖组成分析 采用高效液相法[23]。
1.2.9 DPPH自由基清除能力测定 取500 μL质量浓度依次为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/mL的DOP-w和DOP-p多糖提取液，加入500 μL DPPH无水乙醇溶液(0.1 mg/mL)，振荡混匀，黑暗中放置30 min。以蒸馏水为空白溶液，测定517 nm处吸光度，用维生素C溶液为对照，其质量浓度依次为0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL。并按式(1)计算DPPH自由基清除率。
(1)
式中：
CDPPH——DPPH自由基清除率，%；
A1——样品测定吸光度值；
A2——样品溶液本底的吸光度值；
A0——空白对照溶液的吸光度值。
1.2.10 Fe3+还原能力测定 取200 μL质量浓度依次为0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/mL的DOP-w和DOP-p多糖提取液，加入500 μL磷酸盐缓冲溶液(0.2 mol/L，pH 6.6)，加入500 μL 0.01 g/mL的铁氰化钾溶液，混匀，50 ℃水浴20 min，加入500 μL 0.1 g/mL三氯乙酸离心10 min，取上清液500 μL，依次加入500 μL去离子水和100 μL 0.001 g/mL三氯化铁溶液，混匀，静置10 min，测定700 nm处吸光度值。以去离子水代替三氯化铁作为空白，用维生素C代替样品溶液作对照。并按式(2)计算Fe3+还原力。
CFe3+=A1-A2，
(2)
式中：
CFe3+——Fe3+还原力；
A1——样品吸光度值；
A2——空白对照溶液的吸光度值。
1.2.11 羟自由基清除能力测定 取500 μL不同质量浓度的多糖提取液，依次加入150 μL 2 mg/mL的硫酸亚铁水溶液、500 μL 1%过氧化氢溶液及500 μL 1.5 mg/mL的水杨酸乙醇溶液后，振荡混匀，37 ℃水浴1 h，测定526 nm 处吸光度值；
以无水乙醇代替水杨酸乙醇溶液，测定样品溶液本底的吸光度值；
以去离子水代替样品溶液，测定空白对照溶液的吸光度值，用维生素C代替样品溶液作对照。并按式(3)计算羟自由基清除率。
(3)
式中：
COH——羟自由基清除率，%；
A1——样品吸光度值；
A2——样品溶液本底的吸光度值；
A0——空白对照溶液的吸光度值。
1.2.12 Fe2+螯合能力测定 取1 mL不同质量浓度的多糖提取液，加入3.7 mL去离子水，0.1 mL 2 mmol/L氯化亚铁溶液，混匀，加入0.2 mL 5 mmol/L的Ferrozine溶液，室温静置10 min，测定562 nm处吸光值。以去离子水代替样品溶液为空白对照，以去离子水代替氯化亚铁溶液为校准管。用EDTA代替样品溶液作对照，其质量浓度依次为0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL。并按式(4)计算Fe2+螯合能力。
(4)
式中：
CFe2+——Fe2+螯合能力，%；
A1——样品吸光度值；
A2——空白对照溶液的吸光度值；
A0——校准管的吸光度值。
1.2.13 总抗氧化能力(T-AOC)测定 根据试剂盒说明书进行，并按式(5)计算总抗氧化能力。
(5)
式中：
U——总抗氧化能力，U/mL；
A1——样品吸光度值；
A0——空白对照溶液的吸光度值。
1.3 数据处理
采用GraphPad Prism 8.0.2软件进行数据统计分析及绘图，结果以平均值±标准差表示。
2.1 铁皮石斛多糖的超高压提取工艺优化
考察超高压压力、保压时间、料液比3个因素对铁皮石斛多糖得率的影响。正交试验因素水平见表1，正交试验设计及结果见表2。
表1 超高压正交试验因素与水平表
由表2可知，各因素对DOP-p得率的影响依次为超高压压力>料液比>保压时间，说明超高压压力的影响最大，保压时间的影响最小，各因素在考察范围内均影响显著(P<0.05)。最优方案为A1B2C3，即最佳提取条件为料液比1∶25(g/mL)，超高压压力200 MPa，保压时间5 min。
表2 超高压提取铁皮石斛多糖正交试验结果
2.2 两种铁皮石斛多糖基本性质比较
2.2.1 正交试验验证及基本性质比较 由表3可知，最佳提取条件下DOP-p得率为33.3%，残渣复提得率为6.5%，综合计算得经超高压提取石斛粉总得率为39.8%，远高于中国药典所要求的25%。优化后的超高压提取方法在得率上相较于传统热水浸提法提高了128%，且提取时间更短，提取温度更低。因此，超高压提取可以有效提高铁皮石斛多糖得率。此外，DOP-w的蛋白含量为4.6%，DOP-p的蛋白含量为3.5%，超高压提取法相对传统热水浸提方法降低了铁皮石斛多糖蛋白含量，可能是因为超高压处理的温度更低，处理条件相对更温和，进入糖液中的蛋白质含量相对较低。
表3 两种铁皮石斛多糖工艺参数及得率对比
2.2.2 相对分子量比较 由图1可知，热水提取的多糖DOP-w和超高压提取的多糖DOP-p均有3个峰，DOP-w的3个峰所对应的相对分子量分别为5.4×107，1.9×105，588.9 Da。DOP-p的3个峰所对应的相对分子量分别为3.2×105，1.5×104，527.9 Da，不同提取方式下铁皮石斛多糖的相对分子量存在差异，DOP-p的相对分子量小于DOP-w。林平舟[24]发现，超高压提取的荔枝多糖重均分子量显著小于热水提取法提取的，由3.20×105下降至1.9×105，可能是由于超高压中强烈的机械剪切作用打断了多糖的糖链[25]。
图1 两种铁皮石斛多糖的相对分子量比较
2.2.3 单糖组成比较 由表4可知，铁皮石斛多糖DOP-w和DOP-p为杂多糖，均含有甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖，DOP-w还含有一定量的N-乙酰-氨基葡萄糖。其中，铁皮石斛多糖最主要的成分是甘露糖和葡萄糖，DOP-w的甘露糖和葡萄糖比例为1.06∶1，DOP-p的甘露糖和葡萄糖比例为1.71∶1，高于DOP-w。而甘露糖含量及其与葡萄糖的比例是石斛多糖生理活性的重要因素，国标[18]规定药用石斛多糖甘露糖含量不得少于13%。超高压提取的铁皮石斛多糖含有更高的甘露糖可能是其具有更高抗氧化能力的因素之一。
表4 DOP-w和DOP-p的单糖组成
2.3 抗氧化能力
2.3.1 对DPPH自由基的清除能力 研究[26-28]表明，铁皮石斛多糖在体内和体外均具有良好的抗氧化活性，但超高压提取对其活性的影响尚不清晰。由图2可知，两种铁皮石斛多糖溶液对DPPH自由基的清除能力均与质量浓度呈正相关，但同一质量浓度下的DOP-w和DOP-p对DPPH自由基的清除能力存在差异。维生素C对DPPH自由基的清除能力远远强于铁皮石斛多糖，当质量浓度为0.04 mg/mL时，维生素C对DPPH自由基的清除率达90%，但当多糖溶液质量浓度为3 mg/mL时，DOP-w的清除率为39.7%，DOP-p的为53.1%，说明DOP-p对DPPH自由基的清除能力高于DOP-w。
图2 两种铁皮石斛多糖对DPPH自由基清除能力的影响
2.3.2 对Fe3+的还原能力 由图3可知，DOP-w、DOP-p对Fe3+的还原力均随样品溶液质量浓度的升高而增强，呈明显的剂量效应。当质量浓度为3 mg/mL时，DOP-p对Fe3+的还原能力为0.15，高于DOP-w的0.14，但其差距在各质量浓度下均不明显，说明两种方法提取的铁皮石斛多糖对Fe3+的还原能力差异较小。
图3 两种铁皮石斛多糖对Fe3+的还原能力
2.3.3 对羟自由基清除能力的比较 由图4可知，DOP-w在各质量浓度下对羟自由基的清除能力均高于DOP-w。当质量浓度为3 mg/mL时，DOP-w对羟基自由基的清除率为10.0%，DOP-p的清除率为14.2%。
图4 两种铁皮石斛多糖对羟自由基清除能力的比较
2.3.4 对Fe2+螯合能力的比较 由图5可知，两种铁皮石斛多糖对Fe2+的螯合能力均与质量浓度呈正相关，存在明显的剂量效应，但同一质量浓度下，DOP-w和DOP-p对Fe2+的螯合能力存在差异。EDTA对Fe2+的螯合能力远远强于铁皮石斛多糖，当质量浓度为0.1 mg/mL时，EDTA对Fe2+的螯合率达87%，而DOP-w在质量浓度为3 mg/mL时的螯合率为56.2%，DOP-p的为60.8%，两种多糖对Fe2+的螯合率差异较小，但总体来说，螯合能力大小为DOP-p>DOP-w。
图5 两种铁皮石斛多糖对Fe2+的螯合能力
2.3.5 总抗氧化能力(T-AOC)比较 由图6可知，DOP-w和DOP-p对Fe3+的还原力均随样品质量浓度的升高而增强，呈明显的剂量—作用关系。且DOP-p在各质量浓度下的总抗氧化能力均高于DOP-w，说明超高压提取的铁皮石斛多糖的总抗氧化能力强于热水提取法提取的，与Luo等[29]的结果基本一致。
图6 两种铁皮石斛多糖的总抗氧化能力比较
采用正交试验优化了超高压技术提取铁皮石斛多糖的工艺条件，比较了传统热水浸提法、超高压法两种提取方法下的铁皮石斛多糖的相对分子量及单糖组成，并分析了两种铁皮石斛多糖的体外抗氧化活性。结果表明，超高压技术可以显著提高铁皮石斛干粉的多糖得率。优化后的超高压提取铁皮石斛多糖的工艺条件为超高压压力200 MPa，料液比1∶25(g/mL)，保压时间5 min，此条件下铁皮石斛多糖得率为33.3%，比传统热水浸提法下的提高了128%。两种提取方法下铁皮石斛多糖的性质不同，超高压法提取的多糖蛋白含量和相对分子量下降，甘露糖含量提高。相较于传统的热水浸提法，超高压提取可以有效提高铁皮石斛多糖的体外抗氧化活性。两种铁皮石斛多糖对DPPH自由基、羟自由基均具有一定的清除能力，对Fe3+有一定的还原力，对Fe2+有一定的螯合能力，两种多糖的体外抗氧化能力为高压提取法铁皮石斛粗多糖 > 热水浸提法铁皮石斛粗多糖，且均与多糖浓度呈正相关，量效关系明显。但提取方法究竟如何影响多糖的结构和抗氧化活性尚未完全明晰，后续可对多糖精细结构及糖链结构进行研究。
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