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周蓉，黄柳向
1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410000；
2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410000
功能性便秘(functional constipation，FC)和功能性消化不良(functional dyspepsia，FD)均是临床上常见的功能性疾病。FC是指排除药物及器质性等因素，表现为粪质干硬、排便不尽感、排便费力等，每周自主排便少于3次的一种功能性肠病[1]，其病因可能与生活饮食习惯、肠道菌群失调、生理性括约肌障碍、精神心理等因素有关[2]。促动力药、促分泌剂、泻药、膳食纤维制剂和中成药等治疗是FC的主要治疗手段，生物反馈治疗、改善心理状态有助于提高治疗效果[3]。近年来，肠道微生态调节对FC的效果明显，说明肠道微生态紊乱可能是FC发病的关键因素[4]。FD是一种主要表现为腹部胀满、疼痛、早饱、餐后饱胀，常伴有食欲减退、嗳气、恶心呕吐等不适，并需排除器质性运输影响的疾病[5]，发病机制复杂，包括幽门螺旋杆菌感染、胃肠道功能障碍、内脏高敏感性[6]，治疗方法主要为H2受体拮抗剂、质子泵抑制剂、促动力药物、消化酶制剂、精神心理治疗及适当Hp根除治疗[7]。
FC中医属于“便秘”，病位看似在大肠，实则在脾、胃，并与肝关系密切[8]。邱健行认为FC多因寒热外邪、饮食不节、年老体衰引起，病机为气血阴阳亏虚、冷热积滞等[9]。FD中医可归属于“痞满”，病因包括感受外邪、情志失调、饮食不节、禀赋不足和劳倦过度等，基本病机为脾虚气滞，其病位在胃，与肝脾密切相关[10]。FC和FD均为典型的慢性功能性胃肠道疾病，其病因相似，与脾胃关系密切，两者往往伴随出现，兼有腹痛、腹胀等不适[11]。枳术丸是由白术和枳实(21)两味药组成的经典方剂，方中白术健脾燥湿，助脾胃之运化；
枳实破气消积除痞，二者配伍，一补一消，白术的用量是枳实2倍，补重于消，以健脾为主，兼以理气，共奏理气和胃、消痞除满之功[12]。现代药理实验及临床研究均表明，枳术丸治疗消化系统疾病有确切的疗效，体现了该方“异病同治”的特点[13-17]。
中药复方治疗FC和FD疗效好、安全性高，且具有多靶点、多层次的作用机制。网络药理学可以使药物与疾病之间的联系具有整体性、系统性，对发现药物靶点、指导新药研发、揭示中药复方的科学内涵、传承和发展中医药理论均具有一定的指导性[18]。本研究基于网络药理学探讨枳术丸对FC和FD“异病同治”的潜在作用机制。
1.1 枳术丸活性成分及靶点的获取本研究通过中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)检索白术和枳实的化学成分，并根据人体口服药物的生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug-likeness，DL)≥0.18对白术和枳实的化学成分进行筛选，采用TCMSP数据库检索活性成分的相关靶点，然后利用UniProt数据库对筛选出的相关作用靶点蛋白名称进行规范化。将筛选后的药物活性成分与相关靶点导入Cytoscape 3.7.2软件，构建“药物活性成分-靶点”网络图。
1.2 疾病靶点获取以“functional constipation”和“functional dyspepsia”为关键词，选择参数“Relevance score”大于其中位数，在Gene Cards疾病数据库分别筛选出FC及FD的相关疾病靶点。
1.3 枳术丸活性成分相关靶点及FC、FD交集靶点的搜集使用微生信(http：//www.bioinformatics.com.cn)在线作图平台，分别输入枳术丸活性成分靶点与FC和FD的疾病靶点，得到枳术丸治疗FC及FD的潜在靶点和韦恩图，以展示其交互作用关系。
1.4 潜在靶点的蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络构建在STRING数据库(https：//string-db.org)导入潜在靶点，设定物种为人类“Homo sapiens”，蛋白相互关系置信度≥0.4，利用Cytoscape3.7.2软件，使用“Network Analyze”得出其PPI网络图。
1.5 基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信号通路富集分析为深入研究枳术丸对FC和FD“异病同治”的作用途径及机制，将枳术丸治疗FC、FD的潜在靶点导入Metascape数据库(http：//metascape.org)，设定参数为H species且P<0.01，进行GO富集分析和KEGG富集分析，并使用微生信平台绘制出GO簇状条形图与KEGG气泡图。
2.1 枳术丸活性成分及其靶点通过TCMSP数据库共搜集到枳术丸的活性成分120种，其中白术55种，枳实65种，筛选后共得到活性化学成分29种，其中白术7种，枳实22种，见表1。基于TCMSP获得活性成分相关靶点329个，其中白术23个，枳实306个，借助UniProt数据库标准化并去重后得到126个靶点。将药物活性成分及其相关靶点导入Cytoscape 3.7.2软件，得到“药物活性成分-靶点”网络图，见图1。
表1 枳术丸药物活性成分
图1 “药物活性成分-靶点”网络图
2.2 FC、FD疾病靶点以“functional constipation”和“functional dyspepsia”为关键词通过Gene Cards疾病数据库搜索FC靶点2 597个、FD靶点2 523个，选择参数“Relevance score”大于其中位数，筛选出FC和FD的潜在靶点分别有1 299个和1 263个。
2.3 枳术丸治疗FC、FD的潜在靶点在微生信在线作图平台中将FC和FD疾病的靶点及枳术丸药物活性成分靶点进行映射，最终得到枳术丸与FC的交集靶点70个，枳术丸与FD的交集靶点81个，枳术丸、FC及FD三者交集靶点63个，这些靶点可能是枳术丸治疗FC和FD的潜在靶点，导出得到的Venn图。见图2。
图2 枳术丸、FC、FD交集靶点Venn图
2.4 潜在靶点的PPI网络在STRING数据库中导入63个潜在靶点，并在Cytoscape 3.7.2软件中利用“Network Analyze”作出PPI网络图，见图3，图中共63个节点，1 784条边，其中节点表示蛋白，边表示蛋白之间相互作用关系，颜色越深、节点越大则度值越大，表明该靶点关联的靶点越多、作用越关键。根据度值(degree)排序，并以度值大于中位数(32)为条件筛选出核心靶点蛋白32个，这32个靶点蛋白可能是枳术丸治疗FC和FD的关键靶蛋白，见表2。
表2 核心靶点蛋白信息
图3 枳术丸治疗FC、FD的潜在靶点PPI网络图
2.5 GO富集分析通过Metascape数据库，对枳术丸治疗FC和FD的63个潜在靶点进行GO富集分析，设定P<0.01，共得到生物学过程(biological process，BP)1 262个、分子功能(molecular function，MF)98个和细胞学组分(cellular components，CC)62个。BP主要包括对激素的反应(response to hormone)、对氧化应激的反应(response to oxidative stress)、对脂质的反应(cellular response to lipid)、对肽的反应(response to peptide)、对炎症调节的反应(regulation of inflammatory response)等；
MF包括磷酸酶结合(phosphatase binding)、信号传导受体调节活性(signaling receptor regulator activity)、RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合(RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding)、激酶结合(kinase binding)、蛋白质同源二聚化活性(protein homodimerization activity)等；
CC主要包括核包膜(nuclear envelope)、膜筏(membrane raft)、受体复合物(receptor complex)、转录调节剂复合物(transcription regulator complex)、内质网腔(endoplasmic reticulum lumen)等。根据参数Count进行排序，对BP、MF、CC排名前10位的条目用簇状条形图表示，见图4。
图4 潜在靶点GO富集分析条形图
2.6 KEGG富集分析结果KEGG富集分析共得到173条通路，根据P值将KEGG富集分析结果排序，将排名前20位通路作气泡图，见图5。枳术丸治疗FC和FD的潜在靶点参与的关键通路有癌症通路、AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、CLR信号通路、TCR信号通路、细胞凋亡、鞘脂类信号通路、IL-17信号通路、Th17细胞分化等，表明枳术丸可通过不同的信号通路协调发挥对FC和FD的“异病同治”作用。
图5 潜在靶点KEGG信号通路富集分析气泡图
FC和FD是消化系统两种常见的功能性胃肠病，随着生活习惯和饮食结构等的改变，二者发病率逐年升高，严重影响患者的生活质量，中医药在治疗功能性疾病中具有一定的优势[19-20]。异病同治是指不同疾病发生发展过程中出现了相同的病机，便可以采用相同的治疗方法来治疗，异病同治是辨证论治的具体体现[21]。枳术丸对FC和FD异病同治作用的本质即在于辨证论治，FC和FD均为典型的慢性功能性胃肠道疾病，病因相似，且均与脾胃关系密切，而枳术丸临床上常用于治疗脾虚证[17，22]。文献研究发现，枳术丸临床治疗的优势病种包括FC、FD、IBS等，且多用于脾胃虚弱和脾虚气滞之证[23]。研究发现，在慢传输型便秘中，磷脂酶C-γ(PLC-γ)、蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)和磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)的表达水平升高[22-24]，表明枳术丸可有效促进脾虚证慢传输型便秘肠道运动。研究发现，在FD大鼠中，枳术丸可促进胃肠道排空，减轻胃肠道敏感性，可能与5-羟色胺受体(5-HT receptor，5-HTR)和胃促生长素含量升高、降钙素基因相关肽(calcitonin generelated peptide，CGRP)含量降低有关[25]。
本研究设置参数OB≥30%、DL≥0.18获得枳术丸活性成分29个，白术的主要化学成分包括挥发油类、多糖类、内酯类等，具有抗肿瘤、抗炎、调节消化系统的作用，常用于胃肠道疾病的治疗[26]。枳实的主要有效成分为黄酮类、挥发油类及生物碱类化合物，其具有胃肠道调节作用及抗癌、抗氧化、促进脂质代谢、抗菌、抗炎等作用[27]。本研究通过PPI网络拓扑分析共得出32个关键靶点，排名前10位的基因包括AKT1、TNF、TP53、IL-6、CASP3、VEGFA、MAPK3、PPARG、PTGS2、EGFR等。AKT1与血管生成有关，可抑制细胞的凋亡、增殖、转移等过程，促进细胞增殖和细胞存活[28]。在机体炎症反应和免疫调节中，TNF和IL-6起着重要作用，在功能性消化不良患者中血清IL-6和TNF-α水平会升高[29]。TP53与炎症相关，可使损伤的细胞发生凋亡，而在胃肠道中可保持黏膜的完整性[30]。VEGFA具有抗抑郁效应[31]，抑郁小鼠体内VEGF表达水平明显降低[32]。MAPK3与应激、炎症反应密切相关，可增加肠道水分、促进肠道蠕动，恢复慢传输型便秘大鼠的肠道功能[33]。EGFR与肠道结构和功能密切相关，具有促进消化吸收、影响酶活性、修复受损肠道组织和促进肠道发育等作用[34]。PPARG可减少炎症因子的表达、抑制炎症反应，肠道感染会影响PPARγ的表达及活性[35]。前列腺素内过氧化物合酶2是一种诱导型环氧合酶，在FD中，可促进炎性反应并能损伤部分组织，与慢性炎症密切相关[36]。枳术丸通过以上核心靶点通过不同途径调控炎症因子并参与细胞增殖、分化、凋亡等，减少对黏膜、血管的损伤，从多个途径干预FC和FD。
GO富集分析与KEGG富集分析表明，枳术丸通过调控体内多种信号通路对FC、FD发挥共同治疗作用。枳术丸“异病同治”FC和FD主要通过参与调节癌症通路、细胞凋亡、TNF信号通路、TCR信号通路、CLR信号通路、AGE-RAGE信号通路、鞘脂类信号通路、Th17细胞分化及IL-17信号通路等途径发挥调控作用。AGE-RAGE信号通路可以激活并促进炎症反应和氧化应激，两者相互作用，可引起二酰甘油增多，使肝脏、骨骼肌处于高血糖环境，导致糖尿病及其并发症的发生[37]，而FC和FD是糖尿病常见的慢性并发症，其中功能性便秘的发生率占25%[38]。Th17细胞是CD4+T细胞的一组亚型，IL-17在多种炎症性疾病中发挥重要作用，主要通过募集和激活中性粒细胞、诱导T细胞及巨噬细胞产生多种促炎因子从而引起炎症的发生[39-40]。TNF-α是TNF家族中的主要因子，是一种促炎细胞因子，与机体免疫和细胞凋亡关系密切，TNF信号通路改变会增加消化系统炎症的发病风险[41-42]。本研究表明，枳术丸对FC和FD的“异病同治”作用主要是通过减少细胞炎症、激活机体免疫、抑制细胞凋亡等途径而发挥的。
综上所述，枳术丸对FC和FD的异病同治作用机制是多成分、多靶点、多途径的，基于网络药理学探讨其干预FC和FD的作用机制发现，其主要通过减少炎症反应、激活机体免疫、抑制细胞凋亡，减少胃肠黏膜损伤，改善症状，为今后进一步实验研究及临床运用奠定了基础。
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