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栗瑞红，李红霞，李长胜，刘培京，王 飞，顾 扬
（1.呼和浩特市农畜产品质量安全中心，内蒙古呼和浩特 010020；
2．中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100081；
3．江西农业大学生物科学与工程学院，江西南昌 330045；
4．内蒙古盛齐堂生态药植有限公司，内蒙古呼和浩特 011500）
黄芪（Astragalus membranaceusvar.mongholicus）是多年生豆科植物，以干燥根入药，是临床上常见的中药材之一，主要产于我国内蒙古、黑龙江、河北等地[1]。随着人们对黄芪需求量的增多，黄芪的栽培面积也越来越大。但黄芪多年连作，使土壤营养元素缺失，微生物菌群失衡，有害菌群繁殖，土传病害增加[2-3]，再加上中药材栽培过程中长期施用化肥，忽视有机肥的使用，造成肥效下降、肥料利用率不高、土壤板结等弊端。土壤条件的恶化使中药材的品质降低，而合理施肥可以改善土壤条件，提高中药材的产量和品质[4]。
近年来，利用有益微生物进行病害生物防治，促进植物生长，提高产量，并调节植物营养成分，改善品质，显示出有利潜力。微生物肥料可以通过改变土壤有效成分、土壤酶活性、土壤微生物种类和数量来改善植物的生长环境，从而促进植物生长并改变其品质[5-6]。李娟等[7]研究发现，生物肥料HZ-24 对黄芪根直径和干重有显著促进作用，推测生物肥料中的假节杆菌可以改变黄芪根际细菌/真菌比例，增强土壤脲酶等活性，增加根瘤重。郭捷等[8]筛选到两株拮抗芽孢杆菌，可以显著促进黄芪皂苷Ⅰ和Ⅱ含量。也有研究表明，在盐碱地上，以甲基营养型芽孢杆菌为主的微生物菌剂对蒙古黄芪的抗逆性、光合作用效率、生长特性和根系产量没有显著性影响，而有机肥增产作用明显[9]。张会会等[10]研究发现3 种微生物菌剂和生物有机肥对黄芪根腐病的防治效果不甚理想。可见，微生物肥料在黄芪栽培上的应用效果在不同地域存在较大差异，作用机制研究还很缺乏，不利于黄芪栽培产量和品质的提升。
本试验以主产于内蒙古的蒙古黄芪为材料，针对多年连作黄芪土壤，比较考察ETS 复合菌剂（ETS）、多维特抗菌剂（DWTK）、多功能维生素菌剂（WSS）3 种微生物菌剂对蒙古黄芪生物量以及土壤真菌群落结构的影响，以期为提高连作黄芪产量和抗病性提供施肥措施和技术途径。
1.1 试验地点
试验地点为内蒙古盛齐堂生态药植有限公司第一基地，位于呼和浩特市和林格尔县城关镇马群沟村。该区域属于中温带半干旱大陆性季风气候，春季多风，气温回升快且冷暖变化大，夏季降水多，主要集中在7月和8月，年均降水量约392 mm。土壤类型为栗褐土，连续5年种植蒙古黄芪。土壤有机质含量7.6%、全氮含量0.45 g/kg、有效磷含量17.00 mg/kg、速效钾含量126.00 mg/kg、pH 值8.6。
1.2 不同菌剂对连作蒙古黄芪生物量的影响
试验时间为2019年4—11月。试验共设置空白（CK）、ETS 复合菌剂（ETS）、多维特抗菌剂（DWTK）、多功能维生素菌剂（WSS）4 个处理，各处理均含3 个平行重复，每个平行为1 个小区，每小区面积60 m2（3 m× 20 m），小区采用随机区组设计，每小区约移栽种苗1 000 株。各菌剂用量为9 kg，ETS为ETS 复合菌剂用清水稀释150 倍后喷施地上部及灌根，DWTK 将多维特抗菌剂（DWTK）稀释300 倍灌根，WSS 采用多功能维生素菌剂（WSS）1∶50 倍液进行灌根。收获后，地上部分刈割后称量重量，根部清洗植株表面泥土晒干表面水分后称量重量。
1.3 不同菌剂对连作蒙古黄芪土壤真菌群落结构的影响
OTU（operational taxonomic unit）是在系统发生学或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系、属、种、分组等）设置的同一标志。要了解一个样本测序结果中的菌种、菌属等数目信息，就需要对序列进行归类操作。通过归类操作，将序列按照彼此的相似性分归为许多小组，一个小组就是一个OTU。根据不同的相似度水平，对所有序列进行OTU 划分，通常对97%相似水平下的OTU 进行生物信息统计分析。Alpha 多样性反映微生物群落的丰富度和多样性，Shannon-Wiener 是用来估算样本中微生物多样性的指数，Shannon-Wiener 值越大，群落多样性越高。Chao1 用来估计群落中OTU数目的指数，与群落丰富度正相关。Observed species指数表示该样本中含有的物种数，数值越高，表明样本物种丰富度越高。PD_whole_tree 是基于系统发育树来计算的一种多样性指数，它用各个样本中OTUs的代表序列构建出系统发育树的距离，将某一个样本中的所有代表序列的枝长加和得到数值，且数值越大，群落多样性越高。
收获后采集蒙古黄芪根部新鲜土样，经土壤总DNA 提取试剂盒提取总DNA 后，利用特异性引物扩增真菌ITS1 基因的ITS1～ITS2 区（引物序列为CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；
TGCGTTCTTCATC GATGC）、使用Agencourt AMPure XP 核酸纯化试剂盒（AXYGEN 公司）进行PCR 产物纯化，由北京奥维森科技有限公司使用Illumina Misep PE300 测序平台进行高通量测序[11]。本试验对测得的Fastq 数据进行质控处理，对所有序列进行OTU 划分，通常对97%相似水平下的OTU 进行生物信息统计分析，参考Unite（Release 7.2 http：//unite.ut.ee/index.php）的真菌数据库对真菌分类信息的注释。基于OTU 的丰度结果，使用Qiime 软件计算样本的Shannon-Wiener 指数等。
Shannon-Wiener 指数
式中，Pi为样品中属于第i种的个体的比例，如样品总个体数为N，第i种个体数为ni，则Pi=ni/N。
式中，Schao1 为估计的OTU 数，Sobs为观测到的OTU 数；
n1为只有一条序列的OTU 数目；
n2为只有两条序列的OTU 数目。
使用SPSS 22.0 统计学软件对蒙古黄芪生物量和土壤主要优势真菌的数据进行单因素方差（ANOVA）分析，采用最小显著性差异法（LSD）分析不同处理间的显著性（P＜0.05）。
2.1 不同菌剂对连作蒙古黄芪生物量影响
由表1 可知，不同菌剂对蒙古黄芪地上部生物量的增长作用不同。所选用的3 种菌剂中，多维特抗菌剂（DWTK）具有显著的促生作用，蒙古黄芪地上部生物量达到每小区24.20 kg，比CK 显著增加了17.5%（P＜0.05）。与CK 相比，ETS 复合菌剂（ETS）和多功能维生素菌剂（WSS）对蒙古黄芪地上部生物量无显著影响（P>0.05）。
表1 不同菌剂对连作蒙古黄芪生物量的影响 单位：kg
不同菌剂对蒙古黄芪根部生物量影响不同。所选用的3 种菌剂中，多维特抗菌剂（DWTK）显著提升蒙古黄芪根部生物量（P＜0.05），达到每小区31.7 kg，比CK 显著增加了18.4%。与CK 相比，ETS 复合菌剂（ETS）和多功能维生素菌剂（WSS）对蒙古黄芪根部生物量无显著影响（P>0.05）。黄芪根部有很高的药用价值，其根部生物量作为产量测算。由此可知，3 种微生物菌剂中多维特抗菌剂增产效果显著。
2.2 不同菌剂对连作蒙古黄芪土壤真菌群落结构的影响
本试验中产生有效OTU 2 981 个，CK、DWTK、ETS、WSS 样本分别有1 019、1 984、1 652、1 461 个OTU。3 种微生物菌剂均能一定程度上增加土壤真菌OTU 数量，其中施用多维特抗菌剂处理的土壤真菌OTU 数量远高于CK，且比CK 提高了94.7%。对连作蒙古黄芪的根际土壤真菌群落进行聚类，由图1 可知，4 个样本共同包含515 个OTU，占总样本数量的17.3%；
DWTK 特有OTU 376 个，占其样本数量的19.1%，与CK 共有28 个OTU；
ETS 特有378 个，与CK 共有35 个OTU；
WSS 特有191 个OTU，与CK 共有25 个OTU。
图1 不同处理蒙古黄芪根际土壤真菌特异OTU 数量
由图2 可知，与CK 相比，DWTK 和ETS 处理均显著增加Shannon-Wiener（P＜0.05）、Chao1（P＜0.000 1）、Observed species（P＜0.000 1）和PD_whole_tree 指数（P＜0.000 1），WSS 处理显著增加Chao1、Observed species 和PD_whole_tree 指数（P＜0.05）。DWTK、ETS和WSS 处理均可显著增加连作蒙古黄芪的根际土壤真菌多样性和丰富度，且DWTK、ETS 处理连作蒙古黄芪的根际土壤真菌多样性和丰富度高于WSS处理。
图2 不同处理的蒙古黄芪根际土壤真菌Alpha 多样性指数
采用RDP Classifier 算法对OTU 代表序列进行比对分析，并在各个水平（family、genus）注释其群落的物种信息，用柱状图可视化观察不同样本（或者分组）的物种组成情况（图3）。图3 显示的是相对丰度1%以上的物种信息。
样本真菌群落结构可以反映不同处理样本在同一分类水平中菌群数量的差异。由图3a 可知，在科水平下，不同处理连作蒙古黄芪的根际土壤真菌群落结构各类真菌类群所占比例均有一定差异，与CK相比，DWTK、ETS 和 WSS 处理癣囊腔菌科（Plectosphaerellaceae）、被孢霉科（Mortierellaceae）和牛肝菌科（Boletaceae）丰度升高，而丛赤壳科（Nectriaceae）、小脆柄菇科（Psathyrellaceae）、似锁瑚菌科（Clavulinaceae）和小球腔菌科（Leptosphaeriaceae）丰度降低；
与ETS 组相比，DWTK 处理Nectriaceae和 Clavulinaceae 丰 度 升 高 ，Mortierellaceae、Psathyrellaceae、Boletaceae 和Leptosphaeriaceae 丰度降低。由图3b 可知，在属水平下，与CK 相比，DWTK、ETS 和 WSS 处 理 癣 囊 腔 菌 属（Plectosphaerella）、赤霉属（Gibberella）、被孢霉属（Mortierella）和牛肝菌属（Boletus）丰度升高，而镰刀菌属（Fusarium）、似锁瑚菌属（Clavulicium）、小脆柄菇属（Psathyrella）和白粉寄生孢属（Ampelomyces）丰度降低，DWTK 和WSS 处理还增加盘菌属（Peziza）丰度。与ETS 相比，DWTK 降低Mortierella、Boletus和Ampelomyces丰度。与其他3 个处理相比，DWTK提高了Gibberella丰度。与CK 相比，3 种微生物菌剂对土壤真菌群落结构的影响明显。
图3 物种组成分析柱状图
研究和开发绿色环保的专用肥料，实现黄芪生态种植，是提高中药材栽培产量和质量的重要措施。相比于传统的化肥，微生物肥料可通过活化矿质元素、提高土壤酶活性等机制提高土壤肥力，并提供生长因子促进植物生长，已广泛应用于作物、蔬菜和果树生产中[12]。合理的施用菌肥还能不同程度地缓解作物因连作出现的土传病害问题[13-14]。前人研究发现，不同菌剂对黄芪增产效果参差不齐[7，10]。本试验所采用的3 种微生物菌剂中仅有多维特抗菌剂（DWTK）对提升蒙古黄芪生物量具有显著的作用，另外两种菌剂没有促生效果。本试验结论与前人研究结果相似。因此，在黄芪种植中采用适宜的微生物菌剂对中药材产量和质量至关重要。本试验多维特抗菌剂（DWTK）还需进行多年、多点试验，明确增产提质效果，才能在内蒙古大规模推广应用。
黄芪连作栽培中的一种常发性土传病害表现为根腐病，病原菌有3 种：腐皮镰刀菌（Fusarium solaniun）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）和锐顶镰刀菌（Fusarium acuminatum）[2-3，15]。本试验所在场地已连续5年种植蒙古黄芪，连作障碍明显，在本试验对照组检出土壤真菌种属中Fusarium丰度较高，是潜在致病菌。本试验并没有研究DWTK 菌剂对Fusarium的拮抗作用。今后，可开展针对Fusarium真菌病害的拮抗菌或抑菌活性物质的筛选研究工作，扩大菌种资源，进一步提高微生物菌剂的效果。
作物根际土壤中微生物群落结构及其组成变化能反映土壤生态现状及变化趋势，对作物健康十分重要[16]。土壤微生物种群的变化是发生连作障碍的原因之一[17]，特别是一些病原微生物的严重富集，真菌种类和数量的增多，细菌等有益菌群的减少[18]。李冰圳等[1]研究发现，采用高通量测序技术检测蒙古黄芪不同发育期根际细菌和真菌群落多样性，黄芪根际真菌主要包括子囊菌门、担子菌门、接合菌门、壶菌门和球囊菌门，真菌群落结构差异受发育期影响较小。HE 等[19]在研究不同种类深色有隔内生真菌和里氏木霉对蒙古黄芪生长的作用机制中发现，在干旱胁迫下，深色有隔内生真菌Acrocalymma vagum、Paraboeremia putaminum和绿色木霉（Trichoderma viride）双重接种可有效提高黄芪根际有效N、P 和K含量，子囊菌门（Ascomycota）是真菌群落的优势门，且联合接种对细菌群落结构的影响大于对真菌群落结构的影响。本试验使用的3 种微生物菌剂也能影响蒙古黄芪土壤真菌群落结构，其中多维特抗菌剂（DWTK）降低病原菌Fusarium丰度，同时较其他3 个处理提高了Gibberella丰度。多维特抗菌剂（DWTK）组生物量比对照显著增加的原因可能是降低病原菌Fusarium丰度，与Gibberella产生促进植物生长的赤霉素的共同作用。关于Gibberella是否可以促进蒙古黄芪生物量提高，对蒙古黄芪生长的影响这点可以做进一步研究。今后，可深入研究多维特抗菌剂降低病原真菌Fusarium等真菌菌群丰度的分子机制，为优良菌剂的应用推广提供坚实理论基础。
在连续种植蒙古黄芪多年地块上，多维特抗菌剂（DWTK）对蒙古黄芪具有显著促生作用，地上部分生物量比对照增加了17.5%，根部生物量比对照显著增加了18.4%。施用微生物菌剂均能一定程度上增加土壤真菌群落数量，从而改善土壤环境。施用多维特抗菌剂（DWTK）的连作蒙古黄芪根际土壤中，病原真菌Fusarium丰度显著降低，Gibberella丰度显著提高。
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