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李雨喋，王宏宇，韩 松，李俊发
首都医科大学 神经生物学系，北京 100069
卒中是由于脑局部血管突然破裂或阻塞导致血液不能流入供应脑区，而引起脑组织损伤的一种脑血管疾病，其中缺血性卒中占总卒中的75%～80%[1-2]。缺血性卒中发生时，白质损伤发生在多个部位，包括髓鞘、少突胶质细胞、星形胶质细胞和轴突[3]。
在缺血性卒中发展过程中，炎性反应、氧化应激和兴奋性毒性会诱发的神经元死亡，而激活素A通过参与一系列细胞信号调节支持皮层神经元的存活[4-5]。前期研究发现，激活素A还可以通过其ACVR1B/1C有效促进缺血性卒中鼠白质再髓鞘化过程，并改善神经功能预后[6]。在此基础上，利用大脑中动脉闭塞/再灌注(middle cerebral arterial occlusion-reperfusion, MCAO/R)模型，注射腺相关病毒构建条件性基因敲除小鼠，进一步明确激活素A通过ACVR1C是作用于少突胶质前体细胞还是作用于少突胶质细胞来发挥其改善缺血性卒中鼠神经功能预后的作用。
1.1 材料和试剂
实验动物为无特定病原体级8周龄，体质量20～24 g成年雄性Acvr1cflox/flox小鼠，上海汉恒生物科技有限公司提供，首都医科大学伦理委员会审查和批准(许可证编号：AEEI-2020-144)。重组小鼠激活素A(20.65 mg/L，R&D System 公司)、兔源单克隆抗体MBP(1∶1 000, Cell Signaling Technology公司)、兔源多克隆抗体ACVR1C(1∶300，Proteintech公司)和兔源β-actin 单克隆抗体(1∶10 000, Proteintech 公司)购自标注公司。
1.2 方法
1.2.1 小鼠分组及ACVR1C条件性敲除小鼠构建：将小鼠分为空病毒载体假手术组、腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)假手术组、空病毒载体模型组、AAV模型组、空病毒载体激活素A组、AAV激活素A组。无特定病原体级Acvr1cflox/flox小鼠委托上海汉恒生物科技有限公司构建，在首都医科大学实验动物中心扩增繁育。小鼠分笼饲养于恒温(21±2 ℃)、恒湿(50%±10%)和12 h循环光照的标准化屏障环境内，自由取食和饮水。
小鼠出生5周后，分别将在少突胶质前体细胞中特异表达的PDGFRα与cre重组酶构建在一起的腺相关病毒(AAV-PDGFRα-cre)和对照腺相关病毒(AAV-PDGFRα-vector)，同样，分别将在少突胶质细胞中特异表达的PLP 与cre重组酶构建在一起的腺相关病毒(AAV-PLP-cre)和对照腺相关病毒(AAV-PLP-vector)，经脑立体定位注射入Acvr1cflox/flox小鼠侧脑室内，构建少突胶质前体细胞和少突胶质细胞特异性敲除ACVR1C小鼠及相应的对照小鼠。病毒注射3周后，小鼠接受MCAO/R手术。所用腺相关病毒均购自上海汉恒生物科技有限公司。
1.2.2 MCAO/R致缺血性卒中小鼠模型：
小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(60 mg/kg)麻醉，沿颈部中线作1 cm切口并暴露颈总、颈外和颈内动脉。然后，结扎颈总动脉和颈外动脉，并用微血管夹夹住颈内动脉。
将颈外动脉近心端处剪一小口后，插入带有直径为0.23 mm硅胶头的线栓并经颈总动脉转动栓线入颈内动脉后，移除颈内动脉上的动脉夹。将线栓头端退回至颈内动脉分叉处，旋转线栓方向将线栓沿颈内动脉方向插入，直至送到大脑中动脉处。在缺血1 d后，地取出线栓，恢复血液供应，并通过颈外动脉结扎实现再灌注。假手术组只进行手术操作，但不插入线栓。
1.2.3 重组小鼠激活素A注射方法: 向渗透泵内注入浓度为20.65 mg/L 的重组鼠激活素 A溶液，总体积为0.1 mL(磷酸盐缓冲生理盐水溶液稀释)。在MCAO/R 3 d后，将小鼠麻醉并固定于脑立体定位仪上。用渗透微泵将重组鼠激活素 A注入小鼠的右侧脑室内，并将渗透微泵沿颈后皮下植入到小鼠腿部。之后，以每天295 ng激活素A的剂量连续给药7 d[6]。
1.2.4 Western blot检测ACVR1C蛋白和髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)的表达：将小鼠断头处死，迅速取出胼胝体。在胼胝体中加入适量细胞裂解液C[50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5), 2 mmol/L EDTA, 2 mmol/L EGTA, 50 nmol/L Okadaic acid, 5 mmol/L sodium pyrophosphate, 100 μmol/L sodium vanadate, 1 mmol/L DTT, 50 mmol/L KF, 2% sodium dodecyl sulfate (SDS) 和4种常规蛋白酶抑制剂(1.362 027 pmol/L)]，然后进行匀浆和超声破碎，制备全细胞蛋白。用蛋白定量BCA(bicinchoninic acid，BCA)法进行定量，取30μg总蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)电泳后，将蛋白转印到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF) 膜上。用 10%脱脂牛奶孵育封闭1 h后，孵育相应一抗、二抗。最后加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)反应底物后可见发光反应，所得蛋白印迹结果用 Gel Doc 凝胶成像系统扫描分析，用于检测ACVR1C受体和MBP蛋白的表达水平。
1.2.5 小鼠神经功能的测试：参考文献报道[7]，分别在MCAO/R后第5、7和10天时，对各组小鼠进行了Rodriguez神经功能评分、改良Longa评分和平衡木测试，以评价其神经功能和运动协调能力。
1.3 统计学分析
2.1 构建少突胶质前体细胞和少突胶质细胞ACVR1C条件性敲除小鼠
相对于AAV-PDGFα-vector组和AAV-PLP-vector组，感染了AAV-PDGFα-cre和AAV-PLP-cre腺相关病毒后，小鼠胼胝体中少突胶质前体细胞和少突胶质细胞的ACVR1C蛋白表达水平存在着明显降低(图1)。
Naïve.not previously subjected to experiments; *P<0.001 compared with the corresponding AAV-PDGFα-vector group or AAV-PLP-vector group
2.2 条件性敲除少突胶质前体细胞和少突胶质细胞ACVR1C对激活素A改善缺血性卒中鼠神经功能预后的影响
激活素A可以显著改善(P<0.01或0.001)MCAO/R 7和10 d小鼠的神经功能评分(图2A，D)、Longa评分(图2B，E)和平衡木试验(图2C，F)。条件性敲除少突胶质前体细胞上的ACVR1C后，不能显著影响激活素A改善缺血性卒中鼠的神经功能预后。然而，条件性敲除少突胶质细胞上ACVR1C后，可以明显抑制激活素A改善缺血性卒中鼠的神经功能预后。
The statistical analysis results of the neurological score (A, D), Longa score (B,E) and beam balance test (C, F); *P<0.001 compared with the corresponding sham group; #P<0.01,##P<0.001 compared with the 1 h MCAO/R+AAV-PDGFα-vector group or 1 h MCAO/R+AAV-PLP-vector group; +P<0.05,++P<0.01, +++P<0.001 compared with the 1 h MCAO/R+AAV-PDGFα-cre group or 1 h MCAO/R+AAV-PLP-cre group
2.3 条件性敲除少突胶质前体细胞和少突胶质细胞ACVR1C对激活素A处理缺血性卒中鼠胼胝体内MBP蛋白表达的影响
相较于模型组，激活素 A 可以显著提高MCAO/R10 d小鼠胼胝体内MBP的蛋白表达水平(P<0.05，图3)。条件性敲除少突胶质前体细胞内ACVR1C后，激活素 A 仍可显著提高MCAO/R 10 d小鼠胼胝体内MBP蛋白表达水平 (P<0.05，图3A)。然而，条件性敲除少突胶质细胞内ACVR1C后，激活素 A提高MCAO/R 10 d小鼠胼胝体内MBP蛋白表达水平作用不明显(图3B)。
Representative results (A and B left panel) and quantitative analysis (A and B right panel) demonstrated the MBP expression levels；
*P<0.001 compared with the corresponding sham group; #P<0.05, ##P<0.01 compared with the 1 h MCAO/R+AAV-PDGFα-vector group or 1 h MCAO/R+AAV-PLP-vector group；
++P<0.01 compared with the 1 h MCAO/R+AAV-PDGFα-cre group
面对临床缺血性卒中患者的高发病率，目前主要采取静脉溶栓药物或血管内血栓切除术治疗，然而，这种两种治疗方式都存在着相关的并发症[8]。说明进行更多的药物探索来为缺血性卒中患者选择更佳的治疗方法和减少相关并发症有重要的研究价值。
缺血性卒中发生后白质损伤发生在多个部位，髓鞘是组成白质的重要成分，缺血性卒中后大约有30%的白质会受到损伤并可能发生脱髓鞘病变，而脱髓鞘后也常伴随着髓鞘的再生，即再髓鞘化[9]。再髓鞘化时，小胶质细胞、巨噬细胞或少突胶质细胞谱系细胞表达激活素A配体去结合激活素受体和信号转导辅助受体，加速再髓鞘化[10-11]。MBP是髓鞘完整性的重要指标，其表达水平在大脑中动脉缺血/再灌注模型中有显著的降低，但在给予了激活素A后表达水平又有明显的增加，说明激活素 A 可能在髓鞘损伤后的再髓鞘化过程中发挥着重要的积极作用。
由此可见，激活素A不仅可以提高缺血性卒中发生后皮层神经元的存活率，还可以在白质再髓鞘化中起到积极效应，对于其究竟通过什么受体来减轻缺血性卒中的白质损伤还需要进行探索。激活素受体(ACVR1)是激活素复合体的一个组成部分，也被称为激活素受体样激酶(ALK)，目前已鉴定出了7种激活素受体(activin-like kinase receptor-7,ALK1-ALK7)，其中ACVR1C(ALK7)在下丘脑和垂体神经元内大量表达[12]。ACVR1C及其配体在癌细胞中也发挥着多种作用，包括调节癌细胞侵袭、迁移和凋亡，提示，激活素A可能通过ACVR1C发挥着重要作用[13]。ACVR1信号可也以通过调控少突胶质细胞分化和髓鞘压实，从而影响轴突的再髓鞘化[14]。提示，激活素A可以通过少突胶质细胞的ACVR1C改善缺血性卒中鼠神经功能预后。
综上所述，利用ACVR1C条件性基因敲除小鼠发现激活素A可能促进缺血性卒中鼠少突胶质细胞的再髓鞘化。激活素A可能通过ACVR1C促进少突胶质细胞而非少突胶质前体细胞的再髓鞘化来改善缺血性卒中鼠神经功能的预后。所获结果为临床寻找新的防治缺血性卒中的潜在治疗靶点提供了一些理论依据。
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