【www.zhangdahai.com--信息简报】
【摘要】自然界仅有RNA病毒以RNA作为基因载体。依赖于RNA的RNA聚合酶（RdRp）在这种病毒的增殖复制期起到了非常重要的作用，它一方面以病毒RNA为模板复制子代病毒的基因，另一方面也将病毒增殖期间需要的蛋白质和酶类的基因转录成为mRNA，所以它担负了复制酶和转录酶双重功能。由于酶的结构复杂，稳定性差，在分子水平对它进行分析存在许多困难。人类和动物的许多严重疾病是由RNA病毒引起的，如人的SARS、流感、甲肝、丙肝、艾滋病、麻疹、出血热、脑炎、脊灰、某些肿瘤；动物的口蹄疫、猪瘟、鸡瘟等等。RNA病毒不仅严重威胁人类健康，也给工农业生产带来巨大损失，因此加强RNA病毒研究不仅是开启生命起源神秘大门的钥匙，也是保护人类健康，促进农业生产和生物多样性研究与保护的重要途径。本文仅就RNA病毒的RNA聚合酶以及反向遗传学这两个方面的研究进展做一简单介绍。
【关键词】RNA病毒；RNA聚合酶
【中图分类号】R373【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)12-0025-03
地球上的原始生命形态是从RNA开始的。在RNA作为生命起源的进化历程中，RNA病毒起了不可替代的作用。自然界中RNA病毒的种类和数量都堪称病毒之冠，其基因组转录复制的多样性也可谓病毒之首。所有的RNA病毒在病毒基因组的复制过程中都编码一个依赖RNA的RNA聚合酶。此酶与宿主的蛋白质（有时还需病毒的蛋白质）一起发挥催化功能[2，3]。在其序列保守性方面，绝大多数RNA聚合酶蛋白已经被阐明；然而关于这类酶的催化活性，到目前为止只有少数几种已从生化的角度得到研究阐述，这包括：Qβ复制酶亚单位II[4]，脊髓灰质炎病毒的3D Pol蛋白[5～7]，丙型肝炎病毒NS5B蛋白[8～10]和烟草脉斑驳病毒(TVMV)的核内包涵体蛋白NIB[11]。
Kamer和Argos于1984年阐明了几种序列基元，它们在某些动物和植物的正链RNA病毒的RDRPs和脊髓灰质炎病毒的3D聚合酶中广泛存在。以后的研究在此基础之上又扩展至更广范围的病毒和更多的基序。到如今已经发现8个保守的RDRP基序[12，13]。现已知这8个保守基序中的4个存在于所有聚合酶的“掌部”结构域中的催化活性部位[14，15]。当前，对于脊髓灰质炎病毒的3D Pol蛋白的研究日趋深入[14]。这项工作的目的是以脊髓灰质炎病毒的聚合酶的晶体结构做指导，利用计算机预测多种RDRPS的二级结构并对结构与功能的关系进行分析。目前面临的问题有：其它病毒的RDRPS也具有与脊髓灰质炎病毒的聚合酶相同的结构吗？它们也具有脊髓灰质炎病毒的聚合酶所具有的独特区域吗？它们在一致序列的相似区域中也存在可以识别的掌部基序吗?
RDRP的结构和功能的分析不可能完全游离于其他三种聚合酶之外，所以在此简要介绍一下依赖DNA的DNA聚合酶（DDDPs）、依赖DNA的RNA聚合酶（DDRPs）和逆转录酶（RT）的晶体学研究。第一个结构研究清楚的是Escherichia Coli的DNA聚合酶I的Klenow片段（KF），这是一个DDDP[15]。此酶的整体形状好象一只带有手指、手掌和大拇指亚结构域的“右手”（图A）。在1992年报道了HIV-I RT的结构[16]。两种聚合酶的结构比较发现，尽管在这两种蛋白之间缺乏序列上的一致性，它们都具有“右手”形状的三级结构。这揭示相对于一级序列，酶的三级结构似乎更具保守性。KF和HIV RT的“手掌”亚结构域可以互相重叠，被认为是同源的[17]。两种酶的“大拇指”结构域大多数是α-螺旋，但是它们的二级结构的排列并不相同。HIV RT的“手指”亚结构域大部分由B-折叠组成，而KF的“手指”亚结构域大部分由α-螺旋组成[17]。而且， KF，T7 RPO和HIV RT中编码“手指”和“大拇指”亚结构域的基因序列的线性排列也互不相同（图2）。
Sousa等人于1993年描述了T7 RNA聚合酶(T7 RPO)的晶体结构。此酶的“手指”、“手掌”和“大拇指”亚结构域均与KF极为相似。这提示KF和T7 RPO中主要由α-螺旋构成的“手指”亚结构域是依赖DNA的聚合酶的一个特点；而HIV RT中主要由β-折叠构成的“手指”是那些既能以RNA又能以DNA为模板的聚合酶的一个特点[16, 18]。
接下来的关于聚合酶与DNA引物-模板共聚体的研究更增加了我们对于聚合酶的结构与功能的理解。迄今为止已经获得了HIV RT的聚合酶共聚体的结构[19];许多DDDPs，包括E.Coli(KF;[20])，B.Stearo Thermo PhiluS[21]和T.A Quaticus(TAQ;22)的同种的Pol I的共聚体结构;以及T7 DNA聚合酶的共聚体结构[23]。这些研究使我们逐渐明了了聚合酶-模板之间发生的相互作用和催化反应。引物-模板与“手指”、“手掌”和“大拇指”亚结构域通过直接的由水介导的主链的内部作用而定位，这使得酶与DNA能以一种序列各自独立的方式结合。蛋白和碱基间的唯一接触是在活性位点附近，其作用是保证合成的忠实性。DNA模板-引物以A-构象和B-构象结合成杂合体（图A）。尽管活性位点上游4-5个碱基对处的双螺旋是B-构象，在接近活性位点处的碱基对却因具有宽而平的小沟而使人联想起A-构象的DNA双螺旋。这样，一个嘌呤的N3位和一个嘧啶的O2位可以特定的氢键而形成新的碱基对。这两个基团在G：C碱基对和A：T碱基对中表现一致[24]而且可以和通常的Watson-Crick形式的碱基对相互识别。
这些研究也说明核苷酸结合位点是由“手指”、“手掌”亚结构域的氨基酸、模板的碱基以及临近的碱基对经复杂的内部作用而构成的。这个“口袋”有助于选择正确配对的核苷酸，因为如果是错配，核苷酸就不能以合适的几何构型进行结合。最初，我们猜想模板DNA穿过酶的“手指”和“手掌”亚结构域间的狭缝[15，16]，然而，晶体结构显示事实并非如此。在晶体结构中，引物链的3’末端位于保守的天冬氨酸附近，这些天冬氨酸在催化活性中心起关键作用；而模板链的5’末端在酶的“手指”和“手掌”亚结构域的影响下急拐了一个90度的弯（图1）。酶的“手指”和“大拇指”亚结构域的位置因是否结合了模板链而有所不同。当没有结合模板链时，聚合酶处于一种开放的状态。然而，当模板结合上来以后，酶的“手指”和“大拇指”亚结构域就合拢，形成一个“钳子”钳住DNA链。“大拇指”的指尖在小沟中活性位点上游4-5bp处经水介导直接或间接地与磷酸二酯主链发生相互作用[23]。在有模板结合时，“钳子”的“大拇指”部分被认为是固定不动的；而“手指”亚结构域的一部分可以随着每一个碱基对的形成而打开和关闭[22，23]。
催化反应包括据信在所有的聚合酶中都会发生的保守的羧化作用[17，25]。这种“二金属离子”机制最初是在类似的DNA聚合酶I的3’-5’核酸外切活性机制的基础上提出的[17，26]。在此机制之中，两个金属离子通过两个羧基、水、生长链的3’-OH和三磷酸腺苷中非酯化的氧原子联系在一起（图3）。金属A激活α磷酸的3’-OH的亲核攻击，而金属B稳定焦磷酸防止其脱离集团。
病毒RNA聚合酶的氨基酸序列比较研究证实保守区域有下面三种功能：包括RNA聚合、三磷酸核苷酸 (NTP)结合、模板和产物结合的RNA聚合酶功能；对分子内二级结构或模板 -产物双倍体的RNA进行解链的螺旋酶功能；RNA戴帽的甲基转移酶功能。典型的GDD三肽现在被认为是RNA聚合酶的明显标记，许多情况下，GDD由酪氨酸领头定位在疏水氨基酸的延伸处。（Y）GDD周围的序列在复制阶段相同的每组病毒中具有同源性。复制过程中来源于不同正链和负链病毒的RNA聚合酶，即使在最保守的GDD区也有差异。分段负链病毒的保守序列是SDD，而非分段的负链病毒的则是GDN(Q)。双股病毒的保守序列更接近于正链病毒，被修改成（Y）MDD[27]。
Poch等认为RNA聚合酶由四个主要的区域组成：A区D*****D为酸性区，B区G***T***(N/E)(S/T)是核苷酸结合的核心区，C区（Y）GDD是催化功能核心区，D区LKR为碱性区。这些区域经常被易变的绞链 (hinges)结构有规则地分隔并联成一个连锁区域[28]。人免疫缺损病毒(HIV)Ⅰ型反转录酶的结构中，保守的（Y）GDD区存在于酶活性中心的β发夹中[29]。Inokuchi等假定这个区参与了金属离子结合于酶催化位置的过程，这在θβ和脊髓灰质炎病毒的RNA聚合酶中得到了证实。这个区域突变能导致酶活性丧失。某些病毒RNA聚合酶该区域的一两个位置上含有不同的氨基酸残基，如：（Y）GDD的酪氨酸在细小核糖核酸病毒的RNA聚合酶中是严格保守的，但在黄病毒中则是易变的。用蛋氨酸取代脊髓灰质炎病毒的（Y）GDD区的酪氨酸则导致功能丧失的突变，这种突变也能被分子内二次突变所抑制。半胱氨酸在TMV、蛋氨酸在南方菜豆花叶病毒(SBMV)，丝氨酸在黄热病毒(YFV)、BMV和AMV的保守区中发现，这个区域氨基酸的改变，可能被其它地方同样分子的二次突变所抑制。有两个非常保守的区域和嘌呤三核苷酸的结合活性相关，A区(G/A****GKS/T)和位于A区下游约20～40个氨基酸处的B区(DEAD)。B区与依赖RNA或DNA的NTP酶活性关联的MG NTP复合体中的MG离子相互作用。两种DNA螺旋酶参与了复制、重组和DNA修复。
有人将脊髓灰质炎病毒3D聚合酶的晶体结构与其他的聚合酶做比较并得出一些结论。首先，脊髓灰质炎病毒聚合酶的总体结构也好象一只右手，这与DDRPS、RTS和DDDPS相一致。其“手掌”亚结构域与其他三种聚合酶中观察到的“手掌”极为相似。这个“手掌”结构域里含有在所有种类的聚合酶中都存在的四氨基酸序列基序：A、B、C和D，除此之外，还有第五个基序E，基序E是RDRPS和RTS所特有的。“大拇指”结构域主要由α-螺旋组成，不过，它和DDRPS、HIV RT或者T7 RPO的“大拇指”的结构并不相似。“手指”亚结构域的大部分在这些晶体中都是不规律的，而其指关节以下的可见部分在结构上与其他种类的聚合酶也不相同。其次，脊髓灰质炎病毒的晶体结构也支持“二金属离子”的催化机制：保守的天冬氨酸为进行催化反应处于合适的位置上。
除了“手指”、“手掌”和“大拇指”亚结构域以外，脊髓灰质炎病毒聚合酶还包括一个独特的手指N-末端区，这在其他种类的聚合酶中并未观察到（图B）。这个区域可能在聚合酶的寡聚反应中起到一定作用。
为了更深入地了解其他病毒的RDRPS，人们将许多RDRPS的预测二级结构与在脊髓灰质炎病毒晶体结构中发现的那些结构相比较。二级结构的预测称为PHD法（来自For Predict at Heidelberg），由Rost和Sander的神经网络法产生。Burkhard Rost 的蛋白预测服务器的网址目前是：http://WWW.emblheidelberg.de/services/sander/predictprotein/pphelptoc.html.PHD法使用一个神经网络，这个神经网络经过了130多个已知晶体结构的晶体化的蛋白质分子链的锤炼。为了得到更为准确的预测，程序使用的是序列的一系列线性排列，而非单一的序列。为了检测方法的准确性，科学家们用程序来预测100多个已知的但程序并不熟悉的蛋白的结构。结果是，如果在预测中使用了合理的序列排列，PHD法对于球形蛋白的准确率可以达到70%以上。最佳的序列排列不含有多余的信息且序列一致性在90%到30%之间。许多聚合酶的或者许多RNA病毒家族公认的聚合酶蛋白的序列已经得到分析。在几种RNA依赖的RNA聚合酶中存在着许多变异。现在，结构方面的知识已经可以解释许多变异造成的影响。
依赖RNA的RNA聚合酶是特殊的复合物，不仅作为RNA复制酶，而且也作为转录酶。不仅催化RNA的聚合，而且也进行RNA的修饰。关于依赖于RNA的RNA聚合酶的研究是目前RNA病毒分子生物学研究非常活跃的领域，对它的深入研究将继续朝着两个方向发展：一是参与每一反应的功能区域的图谱分析；二是探索复制酶和转录酶之间内部转换的分子机制，它们必将成为人类最终攻克RNA病毒的有力武器。
参考文献
[1]Yechiel B.A Short introduction to the origin and molecula revolution of viruses. Virus Genes, 11:73-77.
[2]Buck,K.W.(1996).Comparison of the replication of positive-stranded RNA viruses of plants and animals. Adv. Virus Res.47,159
[3]Lai,M.M.(1998).Cellular factors in the transcription and replication of viral RNA genomes: A parallel to DNA-dependent RNA transcription.Virology,1996,244,1-12.
[4]Landers, T. A., Blumenthal, T., and Weber, K. (1974). Function and structure in ribonucleic acid phage Q beta ribonucleic acid replicase: The roles of the different subunits in transcription on synthetic template. J. Biol. Chem. 249, 5801-8.
[5]Neulfeld, K. L., Richards, O. C., and Ehrenfeld, E. (1991). Purification, characterization and comparison of poliovirus RNA polymerase from native and recombinant sources. J. Biol. Chem. 266, 24212-24219.
[6]Rothstein, M. A., Richards, O. C., Amin, C., and Ehrenfeld, E. (1988). Enzymatic activity of poliovirus RNA polymerase synthesized in Escherichia coli from viral cDNA. Virology 164, 301-308.
[7]Van Dyke, T. A., and Flanegan, J. B. (1980). Identification of poliovirus polypeptide p63 as soluble RNA-dependent RNA polymerase. J. Virol. 35, 733-740.
[8]Behrens, S. E., Tomei, L., and De Francesco, R. (1997). Identification and properties of the RNA-dependent RNA polymerase of hepatitis C virus. EMBO J. 15, 12-22.
[9]Lohmann, V., Kroner, F., Herian, U., and Bartenschlager, R. (1997). Biochemical properties of hepatitis C virus NS5B RNA-dependent RNA polymerase and identification of amino acid sequence motifs essential for enzymatic activity. J. Virol. 71, 8416-8428.
[10]Yuan, Z. H., Kumar, U., Thomas, H. C., Wen, Y. M., and Monjardino, J. (1997). Expression, purification, and partial characterization of HCV RNA polymerase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 232, 231-235.
[11]Hong, Y., and Hunt, A. G. (1996). RNA polymerase activity catalyzed by a potyvirus-encoded RNA-dependent RNA polymerase. Virology 226, 146-151.
[12]Koonin, E. V. (1991). The phylogeny of RNA-dependent RNA polymerases of positive-strand RNA viruses. J. Gen. Virol. 72, 2197-2206.
[13]Poch, O., Sauvaget, I., Delarue, M., and Tordo, N. (1989). Identification of four conserved motifs among the RNA-dependent polymerase encoding elements. EMBO J. 12, 3867-3874.
[14]Hansen, J. L., Long, A. M., and Schultz, S. C. (1997). Structure of the RNA-dependent RNA polymerase of poliovirus. Structure 5, 1109-1122.
[15]Ollis, D. L., Brick, P., Hamlin, R., Xuong, N. G., and Steitz, T. A. (1985). Structure of large fragment of Escherichia coli DNA polymerase I complexed with dTMP. Nature 313, 762
[16]Kohlstaedt, L. A., Wang, J., Friedman, J. M., Rice, P. A., and Steitz, T. A. (1992). Crystal structure at 3.5 ? resolution of HIV-1 reverse transcriptase complexed wit an inhibitor. Science 256, 1783-1790.
[17]Steitz, T. A. (1993). DNA and RNA-dependent DNA polymerases. Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 31.
[18]Sousa, R., Chung, Y. J., Rose, J. P., and Wang, B. (1993). Crystal structure of bacteriophge T7 RNA polymerase at 3.3 resolution. Nature 364, 593-599.
[19]Jacobo-Molina, A., Ding, J., Nanni, R. G., Clark, A. D., Jr., Lu, X., Tantillo, C., Williams, R. L., Kamer, G., Ferris, A. L., Clark, P., Hizi, A., Hughes, S. H., and Arnold, E. (1993). Crystal structure of human immunodeficiency virus type I reverse transcriptase complexed with doublestranded DNA at 3.0 ? resolution shows bent DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6320-6324.
[20]Beese, L. S., Derbyshire, V., and Steitz, T. A. (1993). Structure of DNA polymerase I Klenow fragment bound to duplex DNA. Science 260, 352-355.
[21]Kiefer, J. R., Mao, C., Braman, J. C., and Beese, L. S Visualizing DNA replication in a catalytically active Bacillus DNA polymerase crystal. Nature ,1998,91, 304-307.
[22]Eom, S. H., Wang, J., and Steitz, T. (1996). Structure of Taq polymerase with DNA at the polymerase active site. Nature 382, 278-281.
[23]Doublie′ , S., Stanley, T., Long, A. M., Richardson, C. C., and Ellenberger, T. (1998). Crystal structure of a bacteriophage T7 DNA replication complex at 2.2resolution. Nature 391, 251
[24]Seeman, N. C., Rosenberg, J. M., and Rich, A. (1976). A sequencespecific recognition of double helical nucleic acids by proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 804-808.
[25]Steitz, T. A. (1998). A mechanism for all polymerases. Nature 391, 231-232.
[26]Beese, L. S., and Steitz, T. A. (1991). Structural basis for the 39-59 exonuclease activity of Escherichia coli DNA polymerase I: A two metal ion mechanism. EMBO J. 10, 25-33.
(收稿日期：2009.03.10)
