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【摘要】 目的 通过离体活性实验来研究morphiceptin中苯丙氨酸的角色。方法 通过豚鼠回肠纵行肌（GPI）实验和小鼠输精管（MVD）实验鉴定所有化合物的离体活性。结果 实验表明在morphiceptin的3位引入Hfe或者4位引入Phg能够较好的模拟Phe的作用，D-Phg则效果不佳。结论 morphiceptin的3位和4位的芳环在受体结合中所扮演的角色是不同的。
【关键词】 Mophiceptin；苯丙氨酸模拟物；阿片受体；离体生物检定
In vitro activities of phenylalanine mimics substituted analogues of morphiceptin
【Abstract】 Aim To study the role of phenylalanine in morphiceptin by in vitro bioassay. Methods Their in vitro activities were determined on guinea pig ileum and mouse vas deference. Results In vitro bioassay data showed that introducing Hfe into position 3 or Phg into position 4 could mimic the role of phenylalanine well. D-Phg could not mimic the role of phenylalanine. Conclusion The role of receptor binding for the aromatic group in positon 3 was different from that of position 4.
【Key words】 Morphiceptin; Phenylalanine mimics; Opioid receptors; In vitro bioassay
Morphiceptin（Mcp）是1981年由Chang等在对牛奶蛋白β-casein中的一个七肽片断β-casomorphin的类似物改造中合成出来的一个对μ阿片受体具有较高亲和性和选择性的四肽，序列为：Tyr-Pro-Phe-Pro-NH2，具有镇痛活性[１]。
在阿片肽类似物的改造中，芳香氨基酸尤其是酪氨酸、苯丙氨酸（Phe）的模拟物在非天然氨基酸替换的阿片肽类似物中占有重要的地位，主要原因在于它们所拥有的平坦的芳环平面对于配体跟受体的结合起着重要的作用[2]。本文中我们将先前在Mcp中分别引入苯基甘氨酸（Phg，L和D构型）和高苯丙氨酸（Hfe）替换苯丙氨酸合成的类似物以及母体共10个化合物进行了离体活性测试，对苯丙氨酸在受体结合中的作用进行探讨[3]。
1 材料与方法
1．1 实验动物和试剂 昆明小鼠和豚鼠，清洁级。所用试剂均为国产分析纯。
1．2 实验仪器 电喷雾质谱仪（美国Mariner公司）；SCL-10A型高效液相色谱仪（日本Shimadzu公司）；JZ100型肌肉张力换能器（河北省高碑店市新航机电设备有限公司）；RM6240型生理记录仪（成都泰盟生物仪器公司）。
1．3 小鼠输精管（MVD）实验 体质量30～35 g雄性昆明系小白鼠，取出两侧输精管，制备好后立即放入盛有持续通入95% O2 和5% CO2 混合气的Krebs液I、恒温（37±0．5）℃的玻璃浴管中，预负荷150 mg，平衡 2 h 后开始实验。电刺激参数：频率 6次/min，波宽 1 ms，负载电压 50 V。记录基础收缩强度，然后分别给予不同剂量的待试药物，记录收缩强度，计算抑制百分率。每次药物作用后，用营养液冲洗5次，平衡15 min。每个剂量至少重复测试5次，IC50根据文献方法计算[4]。
1．4 豚鼠回肠纵行肌（GPI）实验 体质量300～350 g豚鼠，取出近盲肠端的回肠，制备好纵行肌后立即放入上述的玻璃浴管中，预负荷500 mg，平衡2 h 后开始实验。电刺激参数中除波宽调整为0．3~0．5 ms外，其他同MVD实验。剩余方法同MVD实验[4]。
2 结果与讨论
豚鼠回肠纵行肌（GPI）标本上主要富含μ阿片受体，小鼠输精管（MVD）上主要富含δ受体。GPI和MVD是用来检验阿片类药物离体活性的经典模型，可以在某种程度上反应药物激动或拮抗活性的强弱以及受体选择性。所有化合物的离体检定结果见表1。
从表1中的离体器官活性数据我们可以看出，在MVD测试中，类似物2、3、5和6的活性都比morphiceptin有所提高，在GPI上，类似物3、5和6跟morphiceptin的活性差不多。因此在替换3位时Hfe可能是一个比较好的选择，延长一个次甲基可能使得氮端三肽片断的空间构象趋于更加的伸展；在替换4位时，Hfe跟Phg的结果差不多，可能氮端三肽对类似物的活性起到决定性的作用。D-Phg替换4位的类似物活性都比较低，因此，尽管一般认为氮端三肽对类似物的活性起到决定性的作用，但是4位残基的苯环朝向也能对类似物活性产生较大影响。此外，除了类似物2的μ阿片受体选择性丧失较大以外，其它类似物都还是倾向于结合μ阿片受体。类似物3、5和6比morphiceptin的μ阿片受体结合活性更好。
3种非天然氨基酸3位替换时的优劣顺序为：Hfe >Phg >D-Phg，4位替换时为：Phg >Hfe >D-Phg。因此，在morphiceptin的3位引入Hfe或者4位引入Phg能够较好的模拟Phe的作用，D-Phg则效果不佳，3位和4位的芳环在受体结合中所扮演的角色是不同的。这些结果也支持了我们之前的放射配基竞争结合实验的结论[3]。
参考文献
1 Chang KJ, Lillian A, Hazum E, et al. Morphiceptin (NH4-Tyr-Pro-Phe- Pro-CONH2): a potent and specific agonist for morphine (μ) receptors . Science, 1981, 212: 75-77.
2 Longobardo L, Melck D, Siciliano R, et al. β-casomorphins: substitution of phenylalanine with β-homophenylalanine increases the μ-type opioid receptor affinity. Bioorg Med Chem Lett, 2000, 10: 1185-1188.
3 Gao YF, Liu X, Liu WX, et al. Opioid receptor binding and antinociceptive activity of the analogues of endomorphin-2 and morphiceptin with phenylalanine mimics in the position 3 or 4 . Bioorg Med Chem Lett, 2006, 16:3688-3692.
4 徐叔云, 卞如濂, 陈修. 药理实验方法学,人民卫生出版社, 1994.
