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摘要: 目的:通过微生物限度检查方法验证,建立肿节风片的微生物限度检查方法。方法 :采用5种阳性对照菌回收率试验验证本品是否具有抑菌作用。结果:细菌计数采用低速离 心 +培养基稀释法(0.2ml)、霉菌和酵母菌计数采用常规法,稀释剂对照组和试验组各试验 菌的 回收率均高于70%;控制菌采用常规法进行检查,阳性对照菌检出,阴性对照菌未检出。结 论:建立的肿节风片微生物限度检查方法符合《中国药典》2005年版规定,方法可行。
关键词:肿节风片;微生物限度;方法验证
中图分类号: R446.5 文献标识码: B 文章编号: 1008-2409(2009)06-1077-03
肿节风片功效清热解毒,消肿散结,用于肺炎、阑尾炎、蜂窝组织炎属热毒壅盛证侯者,并 可用于癌症辅助治疗。根据其用药途径和制法,本品微生物限度检查应进行细菌数、霉菌和 酵母菌数测定及大肠埃希菌检查。按照《中国药典》2005年版微生物限度检查法[1]规定,方法必须经过验证。
1 仪器与试药
1.1 样品
肿节风片3批(广西河丰药业有限责任公司,批号:050906、051001、060302)。
1.2 菌种
大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CM CC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]。以上菌种 均由广西壮族自治区食品药品检验所提供。
1.3 培养基
营养琼脂培养基(050413)、玫瑰红钠琼脂培养基(050113)(广西壮族自治区食品药品检 验所);胆盐乳糖培养基(BL)(050517)、 改良马丁培养基(050526)、改良马丁琼脂 培养基(050621)(北京陆桥技术有限责任公司); pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(2 0050412)(北京奥博星生物技术有限责任公司)。
1.4 仪器
JJ200电子天平;YXQ-LS-50A全自动立式压力蒸汽灭菌器; GD65-1鼓风干燥箱;TDL-60 C 低速台式离心机;GHP400隔水式恒温培养箱;LRH-250-MS霉菌培养箱;灭菌刻度吸管等。
2 方法与结果
2.1 菌液制备
取经37℃培养18～24h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌营养肉汤培养物和经2 5℃培养24～48h的白色念珠菌改良马丁培养基培养物,分别用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 ml含菌数为50～100cfu的菌悬液,备用。另取经25℃培养7d的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养 物,加入5ml 0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱,吸出孢子悬液,用0.9%无菌氯化钠溶液制 成每1ml含孢子数为50～100cfu的孢子悬液,备用。
2.2 供试液的制备
称取样品10g,置灭菌研钵中,研细,用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液转移并稀释至 100ml,摇匀,作为1∶10的供试液。
2.3 细菌、霉菌和酵母菌计数方法的建立及验证
2.3.1 回收率试验 首先选用金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌作为试验菌株,按常规法进行预试验 ,计算回收率。
试验组:取1∶10供试液1ml和50～100cfu试验菌,分别注入同一平皿中,立即倾注营养琼脂 培养 基。每株试验菌平行制备2个平皿,待凝固后,置规定温度,细菌培养24～48h,白色念珠菌 和黑曲霉培养48～72h,按平皿法测定其菌数。
菌液组:取试验菌50～100cfu注入平皿中,立即倾注琼脂培养基。每株试验菌平行制备 3个 平皿,待凝固后,置规定温度,细菌培养24～48h,白色念珠菌和黑曲霉培养48～72h,测定 所加入的试验菌数。
供试品对照组:取1∶10供试液1ml注入平皿中,立即倾注营养琼脂培养基。待凝固后,置规 定温 度,细菌培养24～48h,白色念珠菌和黑曲霉培养48～72h,按菌落计数方法测定供试品本底 菌数。
稀释剂对照组:取稀释剂pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml和50～100cfu试验菌,分别 注 入同一平皿中。按平皿法测定其菌数,考察稀释剂对试验有无干扰。该对照组各试验菌的回 收率应不低于70%。
结果试验组金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收率均为0%,低于70%,表明肿节风 片对细菌有抑制作用;白色念珠菌回收率为95%,高于70%,表明肿节风片对真菌无抑制作用 ;稀释剂对照组3种试验菌回收率均高于70%,表明pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液无抑菌 作用,对实验无干扰。
根据常规法预试验结果选用枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌作为试验菌株,采用培养基稀 释法、低速离心法(500rpm,5min)、低速离心+培养基稀释法进行进一步的预试验,筛选 能够消除本品抑菌作用的试验方法。结果详见表1。
表1 回收率预试验结果(%)
类 别金黄色葡萄
球菌(%)枯草芽孢
杆菌(%)白色念珠菌
(%)常规法0095常规法稀释剂对照组889284培养基稀释法(0.5ml)00培养基稀释法(0.2ml)1432低速离心法00低速离心+培养基稀释法(0.5ml)4 655低速离心+培养基稀释法(0.2ml)7 780
结果采用低速离心+培养基稀释法(0.2ml),金黄色葡萄球菌回收率为77%、枯草芽孢杆 菌回收率为80%,均高于70%,表明肿节风片对细菌的抑制作用已消除。
根据预试验结果,初步确定肿节风片细菌计数方法为低速离心+培养基稀释法(0.2ml),霉菌和酵母菌计数方法为常规法。
2.3.2 细菌、霉菌和酵母菌计数方法验证 取肿节风片样品3批,细菌按低速离心+培养基稀释法(0.2ml),霉菌和酵母菌按常规法 进行加菌回收率试验。结果详见表2。
表2 肿节风片加菌回收率试验结果(%)
批号大肠埃希
菌(%)金黄色葡
萄球菌(%)枯草芽孢
杆菌(%)白色念
珠菌(%)黑曲霉
(%)05090698799999970510018888918998060302898178106104
3批样品5种规定试验菌的加菌回收率均高于70%,表明肿节风片可按低速离心+培养基稀释 法(0.2ml)进行细菌计数;按常规法进行霉菌和酵母菌计数。
2.4 大肠埃希菌检查方法的建立及验证
首先按常规法进行试验:①试验组取1∶10供试液10ml接种至100ml胆盐乳糖培养基(BL)中,同时加入大肠埃希菌10～1 00cfu,35℃培养24～ 48h。取培养物0.2ml接种至含5ml MUG培养基的试管中,35℃培养。分别于5h、24h在366nm 紫外 线下观察,同时用未接种的MUG培养基作本底对照。然后进行靛基质试验,观察结果。另取 胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于麦康凯琼脂平板,35℃培养18～24h,观察菌落形 态。
阴性菌对照组:以金黄色葡萄球菌作为阴性对照菌,方法同试验组。结果见表3。
表3 大肠埃希菌常规法检查结果
组别胆盐乳糖培养基MUG靛基质麦康凯琼脂试验组产酸产气++呈典型菌落阴性菌对照组无菌生长--无菌生长
结果试验组检出大肠埃希菌,阴性菌对照组未检出金黄色葡萄球菌,表明肿节风片可按常规 法进行大肠埃希菌检查。
3 样品微生物限度检查
根据上述实验结果,取肿节风片3批,细菌数按低速离心+培养基稀释法(0.2ml)进行计 数,霉菌和酵母菌数按常规法进行计数,大肠埃希菌按常规法进行检查。结果见表4。
表4 肿节风片微生物限度检查结果
批号细菌数霉菌和酵母菌数大肠埃希菌结论050906小于10个/g小于10个/g未检出符合规定051001小于10个/g小于10个/g未检出符合规定060302小于10个/g小于10个/g未检出符合规定
4 讨论
实验结果表明,肿节风片对细菌具有一定的抑制作用,在进行细菌数测定时需采取适当的方 法消除其干扰。经过验证,确定肿节风片微生物限度检查法为:细菌数按低速离心+培 养基稀释法(0.2ml)进行计数,霉菌和酵母菌数按常规法进行计数,大肠埃希菌按常规法 进行检查。按此方法5种规定试验菌加菌回收率均高于70%,符合《中国药典》2005年版微生 物限度检查法的规定,方法可行。
参考文献:
[1] 国家药典委员会.中国药典(2005年版.一部)[S].北京∶化学工业出版 社,2005:附录70,附录79.
(收稿日期: 2009-02-23)
[责任编辑 高莉丽 邓德灵]
