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【摘要】 目的 研究人牙周韧带细胞(periodontal ligament cells PDLCs)在溶胶-凝胶生物活性玻璃(sol-gel bioglass,SGBG)/聚羟基烷酸酯(poly-3-hydroxy butyrate-co-3-hydroxy valerate,PHBV)三维支架上的分泌功能,为牙周组织工程支架的选择提供依据。方法 通过体外细胞培养实验,人牙周韧带细胞与SGBG/PHBV体外三维培养的直接接触法,测定上清液羟脯氨酸含量,检测材料对细胞分泌功能的影响。结果 实验组上清液羟脯氨酸含量测定值与对照组有显著性差异,材料不影响细胞的分泌功能,同时支架材料的三维结构更能促进细胞的分泌功能。结论 SGBG/PHBV作为支架材料,有良好的生物相容性,有望应用于牙周组织缺损的组织工程修复。
【关键词】
溶胶-凝胶生物活性玻璃/聚羟基烷酸酯;人牙周韧带细胞;牙周组织工程
The study of the secretory function of Human PDLCs on the scaffold material
CHEN Jian-Hong,HUANG Nan-Nan,TANGQian,et al.Department of Stomatology,the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangzhou,Guangdong 510630,China
【Abstract】 Objective The biocompatibilitybetween SGBG/PHBVandPDLCswereinvestigated toprovidea basis for the choice of the scaffold materialof periodontal tissue engineering.Methods Human PDLCs cultured in vitro were collected and seeded on the three-dimensional scaffolds of SGBG/PHBV,And the effection of the SGBG/PHBV on cell secretory function was observedby spectrophotometry which assayed the biochemical indexs-Hyp in supernate.Results The significant difference ofHYP in supernate between the experiment group and the control group(P[1]取因正畸拨除的第一或第二前磨牙,用组织块培养法进行原代培养。培养液为含10%FBS的DMEM完全培养基,于37℃,5%CO�2,饱和湿度条件下培养。最早第7天,可见组织块边缘游出细胞。待细胞长满瓶底约80%时进行首次传代,4~8代细胞用于实验 。
1.2.2 细胞来源鉴定 利用免疫组化ABC法进行波形丝蛋白单克隆抗体和细胞角蛋白单克隆抗体染色。
1.2.3 直接接触法观察材料形态和功能
1.2.3.1 支架材料准备 SGBG/PHBV块状多孔支架材料,将块状多孔SGBG/PHBV制成5 mm×5 mm×3 mm的方形小块,过氧化氢等离子低温灭菌系统消毒,置24孔板内用不含FBS的DMEM预湿过夜后接种细胞。
1.2.3.2 PDLCs与SGBG/PHBV复合培养 用0.25%胰蛋白酶消化状态良好的细胞,1000 rpm×5 min离心,将细胞浓度调整至1×10�6/ml,接种于材料上,每块接种200 μl,置37℃培养箱中,4 h后补加培养液1~2 ml,以后隔天换液。
1.2.3.3 细胞功能的检测 制备细胞悬液,对照组共设27孔,细胞计数后直接接种于两块24孔板,5×10�4个细胞/孔。实验组三维培养接种方法和密度同前,取27块材料分别培养于两块24孔板的27个孔内。分别在三维培养后12 h,24 h,48 h,各孔吸出细胞上清液1 ml,无菌封存,4℃保存。将共组共54份细胞上清液,按羟脯氨酸试剂盒说明书操作,用分光光度计在550 nm,空白管调零,测各管吸光度。
上清液中羟脯氨酸含量(μg/ml)=测定管吸光度/标准管吸光度×标准管浓度(2 μg/ml)。
换算成相同细胞数的羟脯氨酸含量运用SPAA12.11软件进行统计学分析。
2 结果
2.1 细胞培养及来源鉴定 PDLCs传代后,细胞大多呈长梭形,少量呈多角形,胞体丰满,伸展良好,胞浆均匀,核圆,核仁清晰,细胞排列均匀,密集时呈漩涡状,火焰状。免疫组化ABC法进行波形丝蛋白单克隆抗体和细胞角蛋白单克隆抗体染色,细胞呈波形丝蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,提示细胞来源为外胚间充质。
2.2 化学比色法测定细胞分泌功能
表中可看到,同一时间点内对照组与实验组间行配对t检验,相同的时间点内,实验组的上清液羟脯氨酸量,均值均大于对照组。三组配对t检验,均为P[2]。聚羟基烷酸酯(PHBV)是由细菌发酵产生的热塑性生物聚酯,具有良好的组织相容性,作为骨移植组分,具有增强作用,一定时间内可完全生物降解[3]。将二者进行复合,制成三维立体多孔材料,既能发挥PHBV的局部正性压电效应,刺激骨细胞的生长分化,又能发挥SGBG的骨传导作用和材料三维多孔结构的骨诱导作用。研究结果表明[4],羟基磷灰石多晶体可吸附粘多糖胶样层、粘多糖、糖蛋白,从而在SGBG和骨之间形成有机-无机界面,这种结合非常稳定,有利于新骨在BG表面的形成和生长。PHBV分子链的水解产物的排出及BG表面羟基磷灰石多晶体的形成,对于骨组织在多孔支架上形成、生长和正常的新陈代谢是非常有利的。
进行牙周组织工程研究,首要任务之一是选择符合牙周组织工程的支架材料。传统的生物活性玻璃[5,6],由于是在1400℃左右熔化后经一系列后续加工而成,制备工艺复杂,性能不够稳定。本研究所用的生物活性玻璃,是利用溶胶-凝胶法低温制备的纳米尺寸的SGBG/PHBV,具有很好的生物相容性。生物活性玻璃,应用于单纯骨组织修复的研究较多,但在牙周组织修复的研究较少。本实验所用SGBG/PHBV,国内未见运用于牙周组织工程的研究报道。
细胞培养法是评价生物材料组织相容性的重要方法,与体内实验相比具有简便、重复性好实验条件易于控制等优点。本实验采用直接接触法,通过将体外培养的PDLCs接种到SGBG/PHBV三维支架上复合立体培养,使SGBG/PHBV与牙周组织的主要功能细胞PDLCs直接接触,检测材料对细胞分泌功能的影响,为SGBG/PHBV构建牙周组织工程支架的可能性提供初步的研究数据。将高密度细胞接种在具有一定空间结构,有一定孔隙率,孔径大小,孔间交通的支架材料上,细胞在模拟体内细胞的化学,物理和生物学条件下,在三维基质支架中进行培养称为三维培养[7]。细胞在三维立体的空间结构中生长,能够更好地增殖和行使分泌功能。PDLCs的成纤维表型分泌III型胶原,成骨细胞表型分泌I型胶原。羟脯氨酸特定地存在胶原蛋白中,而不存在于一般的蛋白质中。测定上清液中羟脯氨酸含量,可以定量地反映细胞分泌的胶原含量,研究SGBG/PHBV对PDLCs分泌胶原功能的影响。结果表明材料对PDLCs的增殖和分泌胶原的功能不但均未见抑止作用,而且细胞三维培养更能促进细胞的分泌功能。表明SGBG/PHBV和PDLCs具有良好的生物相容性,SGBG/PHBV可进一步应用于牙周组织工程的研究。
参 考 文 献
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[6] Oscar Peitl Filho,Guy P,Latorre,Larryl Hench.Effect of crystallization on apatite-layer formation of bioactive glass 45s5.Biomed Mat Res,1996,30:509.
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