【www.zhangdahai.com--叙职履职报告】
[摘要] 目的 探讨携带人bFGF和GFP基因慢病毒(lenti-bFGF-GFP)转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)及不同MOI(multiplicity of infection)的转染效率。方法 实验组:带有bFGF和GFP基因慢病毒感染的BMSCs(bFGF -GFP-BMSCs)。空载体组:带GFP基因慢病毒感染的BMSCs(GFP-BMSCs)。空白组:未经感染的BMSCs;ELISA、RT-PCR检测各组细胞培养72h后bFGF的表达。MOI分别为10、30、50转染BMSCs的转染率。结果 bFGF -GFP-BMSCs组表达bFGF蛋白量经ELISA、RT-PCR检测均明显高于GFP-BMSCs组和BMSCs组。MOI为10、30、50、的转染效率分别为36.6%、84.2%、98.5%。结论 带有bFGF和GFP基因慢病毒成功转染骨髓间质干细胞并表达,为bFGF基因修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤奠定了基础。MOI为50时,BMSCs的转染率超过85.0%。
[关键词] 骨髓间充质干细胞;慢病毒;碱性成纤维细胞生长因子(bFGF);绿色荧光蛋白(GFP);基因转染
[中图分类号] R318.5[文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)06-13-04
Experimental Study on bFGF Gene Lentiviral Vector Transfecting BMSCs
WANG XinwuLIU Wenge
Department of Orthopedics,Xiehe Hospital,Fujian Medical University,Fuzhou 350001,China
[Abstract] Objective To explore the ways of bFGF and green fluorescent protein(GFP) gene highly transfected to MSCs by lenti-bFGF -GFP and the efficiency of different MOI(multiplicity of infection)transfected to MSCs. Methods MSCs was subject to different treatments with three groups,that was bFGF-GFP-BMSCs group, GFP-BMSCs group and BMSCs group. 72 hours after culture of MSCs,ELISA and RT-PCR was adopted to quantify the amount of protein and mRNA of bFGF in the different groups. The transfection of different MOI(10,30,50) was transfected into BMSC. Results Both ELISA and RT-PCR experiments discovered this:72 hours after transfection,the amount of bFGF protein of bFGF-GFP-BMSCs group was much higher than these of the GFP-BMSCs group and BMSCs group. When the MOI equal to 10,30,50,the efficiency of lentivirus transfected into MSCs was 36.6%,84.2%,98.5%. Conclusion Lentivirus mediated by bFGF gene and GFP gene can infect MSCs successfully and which can express and secret bFGF protein after transfection. MSCs infected by lentivirus which was mediated by bFGF gene and GFP gene is an efficient way for gene therapy of spinal cord injury(SCI). When MOI equal to 50,the efficiency exceeded 85.0%.
[Key words] Mesenchymal stern cells;Lentivirus;Basic fibroblast growth factor(bFGF);Green fluorescent protein(GFP);Gene transfection
脊髓损伤后损伤节段出现轴突的断裂和髓鞘的崩解,伴随着出现神经元及胶质细胞的坏死与凋亡,局部形成空洞和瘢痕组织,正常的神经传导通路被破坏,干细胞移植以及神经组织工程被认为是最有希望治疗脊髓损伤的途径之一[1]。骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells BMSCs)是干细胞移植进行基因治疗的理想种子细胞,它不仅可以携带目的基因,而且还可以发挥细胞替代和细胞本身的特殊作用[2]。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF 或FGF-2)是成纤维细胞生长因子家族的基本成员,在多种细胞(成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、神经细胞等)的增殖、迁移、分化和生存中起到重要的支持作用[3]。人bFGF有5个亚型,分别为18、22、22.5、24和34KD,其中18KD为基本亚型,其通过旁分泌和自分泌途径来促进细胞增殖和迁移[4]。目前国内尚未发现有关于将bFGF构建在慢病毒载体上,并将其转染MSCs的研究,因此我们拟将带有18KDbFGF基因和报道基因GFP的慢病毒(1entiviral vectors)载体转染BMSCs,为进一步研究bFGF基因转移对脊髓损伤研究提供基础。
1材料与方法
1.1主要材料和试剂
①仪器与试剂:低糖型DMEM培养基(DMEM-LG)、胎牛血清、胰酶购自Gibco公司,小鼠抗大鼠CD44PE、CD106PE、CD45PE、CD11bPE购自美国sigma公司,小鼠抗大鼠CD34FITC、CD90FITC购自ABD公司,RT-PCR试剂盒购自Fermentas,TRIZOL购自invitrogen,DNAMarker(Bioer),倒置显微镜(Olympus,日本),紫外分光光度仪(美国vltrospec 3100 pro),PCR扩增仪(美国Axygen),凝胶图像分析系统gene genius(美国 syngene)。②实验动物:清洁级120g SD大鼠,雌雄不限,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。③病毒株:携带人bFGF和GFP基因的慢病毒载体(lenti-bFGF-GFP)、携带GFP基因的慢病毒载体(lenti-GFP)购自上海吉凯基因化学技术有限公司。
1.2方法
1.2.1大鼠BMSCs的分离、培养及流式细胞仪表型的鉴定 采用全骨髓法。取体重为80～120gSD大鼠(雌雄不限),腹腔注射水合氯醛(0.3mL/100g),浸泡于75%乙醇中10min,无菌条件取双侧股骨、胫骨,剪断两端,用注射器吸取适量DMEM液冲洗股骨、胫骨骨髓腔,将团块细胞吹匀制成细胞悬液,接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,在37℃、5%CO2饱和湿度环境中培养。3d换液以去除未贴壁的造血干细胞,此后每3～4 天换液1次,待贴壁的成纤维样细胞达到80%融合时,用0.25%胰蛋白酶2～3min,按1∶2～3的比例进行传代培养,并记做第1代,标记为P1,依此类推。经2～3次传代即可获得形态均一的MSCs。取第3代已达融合的细胞,0.25%胰蛋白酶消化制备成单细胞悬液,离心后以100μL流式buffer重悬,每个检测管中加入重悬细胞3×105个,取7管分别加入含CD44PE、CD106PE、CD45PE、CD11bPE、CD34FITC、CD90FITC 单克隆抗体,剩余1管不加任何抗体,作空白对照;避光室温孵育30min,1000r/min离心5min,弃上清,以洗脱未结合上的流式抗体洗涤,加入300μL buffer,混匀送流式细胞仪检测。
1.2.2慢病毒感染BMSCs取处于对数生长期的MSCs进行胰酶消化,制成细胞悬液,将细胞悬液接种于6孔板中,每孔细胞数约为5×104。37℃、5%CO2培养箱培养待细胞融合度达到约30%。根据细胞MOI分别为10,30,50加入5×105,1.5×106,2.5×106量的携带人bFGF和GFP基因的慢病毒(lenti- bFGF-GFP),polybrene至终浓度为5μg/mL 感染MSCs,72h后观察慢病毒上报告基因GFP 的表达情况。于荧光显微镜下观察和拍照,随机选取5个高倍镜视野,拍完荧光照片后,在同一视野下拍白光的细胞照片。并根据转染效率公式:绿色荧光细胞数/细胞总数×100%,计算相应MOI值转染MSCs的效率。
1.2.3ELISA检测转染后MSCs中bFGF蛋白的表达分别收集经lenti-bFGF-GFP、lenti -GFP转染BMSCs72h后的培养液上清和未经转染的BMSCs72h后的培养液上清,各取6份培养液上清加到用抗人bFGF单抗包被96孔板中,参照bFGF ELISA定量试剂盒(上海博光科技有限公司)说明进行酶联免疫吸附测定,经加样、洗涤、加生物素标记的抗-IgG抗体、加链霉亲和素-HRP并终止、测定。计算:标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度,再乘以稀释倍数,即可得到培养液中bFGF的浓度。
1.2.4RT-PCR检测转染后MSCs中bFGF基因的表达取MOI为50,MSCs分别转染lenti-bFGF-GFP和lenti-GFP及未转染的MSCs培养后72h,弃上清液,用PBS洗涤2遍后,按Trizol一步法提取总RNA并行RNT光谱分析及定量,每管抽提的细胞RNA样本取1μL用1‰DEPC水稀释100倍,在紫外分光光度计上测定OD260/OD280的值及RNA的浓度。按RT-PCR试剂盒的说明书逆转录为cDNA,再进行PCR扩增。PCR反应总体积30μL,反应条件为95℃ 5min;94℃1min,55℃1min,72℃1min,共30个循环后,于72℃延伸10min。引物的序列如下:扩增bFGF基因的上游引物为5’AGAGCGACCCTCACATCAAG 3’,下游引物为5’ACTGCCCAGTTCGTTTCAGT3’,扩增产物为234bp。扩增内参照β-actin 基因的上游引物为5’TGTTGTCCCT GTATGCCTCTG3’,下游引物为5’ACCGCTCATTGCCGATAGT G3’扩增产物为348bp。反应结束后,琼脂糖凝胶电泳鉴定检测PCR产物,并用凝胶成像系统扫描分析。
2结果
2.1细胞培养相态学观察结果
全骨髓培养法体外分离培养BMSCs,倒置显微镜观察发现,原代细胞刚接种时呈圆形,多数悬浮于培养液中,可见MSCs显圆形分布,折光性好,胞体透亮,与周围的血系细胞相互混杂,3d后大部分细胞都贴壁,呈梭形的成纤维细胞样或多角形改变,核较大,位于细胞中央或边缘。仍有大量悬浮混杂细胞。6d细胞呈现克隆样生长的集落,集落细胞增殖迅速,细胞形态基本为纺锤形的成纤维细胞样,部分呈宽大扁平的多边形,悬浮混杂细胞明显减少。约10～12d时融合成单层,一般能够达到80%～90%,梭型细胞纵轴相互平行排列(图1)。传代细胞24h内完全贴壁,3～4d细胞达到完全融合,呈均匀一致的纺锤形。
2.2流式细胞仪鉴定结果
所培养的第3代细胞高表达表面标志分子CD34、CD90、及CD106阳性率分别为95.26%、99.48%、77.12%,而极低表达造血细胞表面分子:CD45、CD34、CD11b阳性率分别为1.94%、0.02%、1.43%,证明所分离培养的细胞为MSCs,而非造血干细胞(图2)。
2.3GFP在lenti-bFGF-GFP转染的MSC中的表达
以MOI为10、30和50的lenti-bFGF-GFP分别转染MSC后24h,即可见绿色荧光,72h后绿色荧光呈全细胞分布,MOI 为10、30、50是转染效率分别为36.6%、84.2%、98.5%(图3),转染后20d仍可见绿色荧光。随转染滴度的增加,荧光强度也逐渐增强,其中MOI为50时,绿色荧光最强而且细胞未出现明显病态现象。结果表明慢病毒可将bFGF和GFP基因成功转染到MSCs内,且MOI为50时,BMSCs的慢病毒转染率超过了85.0%,可满足试验需求。
2.4ELISA检测目的蛋白bFGF的表达
bFGF -GFP-BMSCs组与2对照组相比显现阳性结果。见表1。
2.5RT-PCR检测目的基因bFGF的表达
三组细胞转染培养72h后,紫外分光光度计上测定OD260/OD280的值均在1.8～2.1。RT-PCR经琼脂糖凝胶电泳示:以100bp-600bp DNA ladder的marker为标志,于234bp、 348bp处可见扩增产物条带,分别为bFGF及β-action内参基因片段。两基因的RT-PCR产物电泳条带的位置与理论值相符(图4)。bFGF-GFP-BMSCs组的bFGF mRNA表达明显增高,GFP-BMSCs组(空载体组)和BMSCs组(空白组)mRNA表达不明显。
3讨论
骨髓间充质干细胞是一种多能干细胞,具有获取方便、来源丰富、不涉及伦理道德问题,在宿主组织中可长期存活并整合,可自体移植,无免疫排斥的问题,体外培养扩增快速。有实验证实,MSCs在体内外均可以诱导分化为神经细胞[5,6]。MSCs现已成为基因转染治疗脊髓损伤的首选载体[7],其移植可以在损伤脊髓中存活、发育、生长、分化并形成神经连接促进功能恢复[8],大量试验已证明骨髓间充质干细胞修复脊髓损伤具有良好的效果[9-10]。本实验以MSCs作为基因转染的目的细胞,不仅获得很高的转染率及在体外连续培养多代均保持对转染基因的稳定表达,而且为后期体内移植治疗脊髓损伤提供了理想的种子细胞。
慢病毒载体能感染分裂期及非分裂期细胞,能使目的基因整合至靶细胞基因组从而实现长期表达;转移的基因片段容量大;可向同一细胞引入多种不同的基因,或对同一细胞反复感染;不易诱发宿主免疫反应,其生物安全性也得以大幅提高[11]。bFGF不仅参与神经组织的修复,而且对损伤的神经细胞具有保护作用[12]。脊髓损伤后,蛋白激酶被激活,破坏细胞骨架,造成膜损伤及最终的细胞溶解死亡,而bFGF可防止或抑制细胞内Ca浓度升高,维持Ca稳定,保护神经元免受兴奋性氨基酸的毒性作用[13]。Mocchetti等[14]在大鼠脊髓挫伤模型中检测出bFGF的升高,其变化以伤后4d最明显,表明脊髓损伤后增多的bFGF具有生物学活性。Lee等[15]的研究表明,bFGF比其他神经营养因子的神经保护作用更大,成年鼠脊髓挫伤后,持续髓内灌注bFGF,脊髓的完全及不完全损伤区明显减少,提示bFGF在脊髓损伤方面起非常重要的作用。本实验中,我们用带有GFP和bFGF基因的慢病毒转染培养的大鼠骨髓MSCs,GFP报告基因的表达产物带有天然的荧光,这样无论是体外基因转染或者转染细胞体内移植后,都可以非常直观的利用荧光显微镜观察目的蛋白的表达位置和情况。通过观察转染细胞相应荧光的有无及强弱,即可判断对目的基因的表达情况,而无需繁琐的鉴定。
本实验利用慢病毒载体将bFGF基因导入大鼠MSCs内,以细胞作为bFGF的发生器,经ELISA检测到转染72h后的MSCs内bFGF呈持续高水平表达,与空载体组和空白组比较具有显著统计学意义,而对照组之间无显著统计学意义。RT-PCR检测实验组在mRNA水平的表达情况亦有类似结果:bFGF-GFP -BMSCs组mRNA较对照组显著减少,而2个对照组间比较无明显差别,说明带有目的基因的慢病毒,不论是在mRNA水平还是蛋白质水平都显著提高bFGF的表达。
本实验采用慢病毒转染的方法相对简单,转染72h后即可进行检测,随着细胞的传代,目的基因能过稳定的遗传给下一代。通过本实验,我们获得可以稳定表达人bFGF基因并携带荧光蛋白标记的MSCs,这为下一步的动物移植治疗脊髓损伤奠定了基础。
[参考文献]
[1] Schwab ME. Repairing the injured spinal cord[J]. Science,2002,295(5557):1029-1031.
[2] Kassem M,Kristiansen M,Abdallah BM. Mesenchymal stem cell:cell biology and potential use in therapy[J]. Basic Clin Pharmacol Toxicol,2004,95(5):209-214.
[3] Bikfalvi A,Klein S,Pintucci G,et al. Biological roles of fibroblast growth factor-2[J]. Endocr Rev,1997,18(1):26-45.
[4] Delrieu I. The high molecular weight isoforms of basic fibroblast growth factor(FGF-2): an insight into an intracrine mechanism[J]. FEBS Lett,2000,468(1):6-10.
[5] Kopen GC, Proekop DJ, Phinney DG. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum,and they diferentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(19):10711-10716.
[6] Woodburv D.Schwarz EJ.Prockop DJ.et a1. Adult rat and human bonemarrow stromal cells differentiate into neurons[J]. J Neurosci Res,2000,61(4):364-370.
[7] Inoue M, Honmou O, Oka S, et al. Comparative analysis of remyelinating potential of focal and intravenous administration of autologous bone marrow cells into the rat demyelinated spinal cord[J]. Glia,2003,44(2):111-118.
[8] Hofstetter CP,Schwarz EJ,Hess D,et a1. Marrow stromal cells from guiding strands in the injured spinal cord and promote recovery[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2002,99(4):2199-2204.
[9] Ullian EM,Harris BT,Wu A,et al. Schwann cells and astrocytes induce synapse formation by spinal motor neurons in culture[J]. Mol Cell Neurosci 2004,25(2):241-251.
[10] Garcia R,Aguiar J,Alberti E,et al. Bone marrow stromal cells produce nerve growth factor and glial cell line-derived neurotrophic factors[J]. Biochem Biophys Res Commun,2004,316(3):753-754.
[11] Kafri T,Van Praag H,Gage FH,et al. Lentiviral vectors:regulated gene expression[J]. Molecular Therapy,2000,1(6):516-521.
[12]Sanuki T,Yumoto E,Komori M,et al. Expression of fibroblast growth factor-2 in the nucleus ambiguus following recurrent laryngeal nerve injury in the rat[J]. Laryngoscope,2000,110:2128-2134.
[13] Mattson MP,Murrain M,Guthrie PB,et al. FGF and glutamate opposing roles in the generation and degeneration of hippocampal neuroarchitecture[J]. J Neurosci,1989,9(11):3728-3740.
[14] Mochetti I,Rabin SJ.colangelo AM,et al. Increased basic fibroblast growth factor expression following contusive spinal cord injury[J]. Exp Nenrol,1996,141(1):154-164.
[15] Lee TT,Green BA,Dietrich WD,et al. Neuroprotective effects of basic fibroblast growth factor following spinal cord contusive injury in the rat[J]. J Nenrotrauma, 1999,16(5):347-356.
(收稿日期:2009-11-06)
