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陆献成 刘志勇 [摘要]目的探讨肺缺血再灌注(L／R)损伤时肺组织中血红素加氧酶－l(H0-1)含量的变化对肺组织中肿瘤坏死因子(TNF－α)、白细胞介素6(IL－6)、白细胞介素10(IL－10)分泌的影响。方法32只健康的sD大鼠随机分成假手术组、缺血再灌注组、H0－1诱导剂组和HO-1抑制剂组。实验结束时取肺组织测湿／干重比(Ⅵ/D)，光镜下计算肺泡损伤数并观察肺组织损伤情况，免疫组织化学法检测肺组织中HO-1蛋白表达，ELIsA法测定肺组织匀浆液中细胞因子TNF-α、IL-6、lL-10的含量。结果HO-1诱导剂组HO-1蛋白表达不仅强于假手术组(P缺血再灌注组>HO-l抑制剂组。结论HO-1可以抑制致炎细胞因子TNF-α、IL-6，上调保护性细胞因子IL-10，从而减轻肺缺血再灌注损伤。
[关键词]血红素加氧酶-l；缺血再灌注损伤；肿瘤坏死因子-a；白细胞介素-6；白细胞介素-10
血红素加氧酶-I(HO-1)也称为热休克蛋白32，是目前研究最多的一种血红素加氧酶同工酶。它可以降解衰老或破损红细胞释放出的血红素，生成胆绿素、胆红素、一氧化碳(CO)和铁蛋白。大量事实证明，HO-1可以减轻由免疫介导、氧化应激、炎性细胞浸润导致的组织损伤，这种保护作用在组织缺血再灌注、器官移植排斥反应中表现尤为明显。在肺缺血再灌注损伤中，氧自由基、钙超载及中性粒细胞浸润起着决定作用，这些作用与细胞因子密切相关。近几年来，细胞因子在肺缺血再灌注损伤中的作用日益受到重视，而HO-1在肺缺血再灌注损伤中的保护作用与细胞因子之间的关系尚未明了。
本实验复制大鼠在体肺缺血再灌注模型，观察应用HO-1诱导剂氯高铁血红素(Hemin)及HO-1抑制剂锌原卟啉(zinc protoporphyrin Ix， znpp-IX)后HO-1表达的变化及其对肺缺血再灌注损伤时细胞因子肿瘤坏死因子(TNF-a)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)分泌的影响。
1 材料和方法
1.1 试剂
Hemin和znpp-IX均购自Sigma公司，其他试剂均为国产分析纯。Heroin、ZnPP-IX用0.1Mol・L-1NaOH溶解，再用0.01mol・L-1磷酸盐缓冲液调节pH值至7.4。TNF-a、IL-6ELISA试剂盒均购自南京晶美生物有限公司，IL-10 ELISA试剂盒购自上海元素生物有限公司，HO-1多克隆抗体、链霉亲和素-生物素-过氧化酶复合物(SABC)免疫组织化学试剂盒及DAB显色剂购自武汉博士德公司。
1.2 资料和方法
成年SD大鼠32只，雌雄不限，体重200－260g(由东南大学医学院动物实验中心提供)，随机分成4组。(1)假手术组：手术前24h腹腔注射生理盐水1ml ・kg-1；(2)缺血再灌注组：缺血再灌注前24h腹腔注射生理盐水1ml・kg-1；(3)HO-1诱导剂组：缺血再灌注前24h腹腔注射Hemin 75μmol・kg-1；(4)HO-1抑制剂组：缺血再灌注前24h腹腔注射Hemin75μmol・kg-1，缺血再灌注前1h再腹腔注射ZnPP-IX40μmol・kg-1。
各组大鼠用戊巴比妥钠(40mg・kg-1)腹腔麻醉，股静脉维持输液(0.5mol・kg-1・min-1左右)。颈部气管切开插管，接小动物呼吸机，机械通气维持呼吸，呼吸比为1:1.5，潮气量为14ml・kg-1，呼吸频率为50次・min-1。胸骨正中切口，股静脉注射肝素(1000u・kg-1)。假手术组不阻断右肺门，持续灌注165min，其余各组在吸气末用无创伤血管夹阻断右肺门45min后开放再灌注120min。
1.3 肺湿／干重比及肺泡损伤数测定
取右肺中叶组织以生理盐水充分漂洗，滤纸吸干，称重为湿重，60％24h烘干称重为干重，两者之比为肺湿／干重比。取右肺上叶肺组织以4％多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，200倍显微镜下连续观察200个肺泡，计算红细胞和白细胞超过2个以上的肺泡(视为损伤肺泡)数，然后计算出损伤肺泡的百分数，作为肺泡损伤的定量评价指标。
1.4 肺组织匀浆液中TNF-a、IL－6、IL-10的测定
右肺下叶组织去除血管与筋膜，用4度生理盐水反复漂洗后剪碎，用匀浆器以4度生理盐水为匀浆介质制备10％肺组织匀浆，4度3000r・min-1离心10min，留取上清液置-80度冰箱保存，待所有取材结束后，ELISA测定TNF-α、IL-6、IL-10，Folin-酚法测定肺匀浆蛋白质浓度。
1.5 HO-1蛋白表达检测
右肺上叶石蜡标本以4μm厚切片，分别按免疫组织化学SABC法染色，封片镜检，棕黄色颗粒为阳性产物。在Olympus400倍镜下准确定位所测视野，由HPIAS－2000高清晰度彩色病理图像分析系统进行处理，每标本随机选取8个不重叠的视野，测定免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度值(OD)，并计算8个视野光密度值的均值，半定量分析HO-1蛋白表达。
1.6 统计学处理
采用SPSS 10.0统计软件，实验数据表示，组间比较用￡检验，等级计数资料比较采用秩和检验。
2 结果
2.1 肺组织HO－1蛋白表达情况比较假手术组肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞HO-1蛋白均无阳性表达，缺血再灌注组和HO-1抑制剂组部分肺泡和支气管上皮细胞可见少数阳性细胞(棕黄色颗粒)，而HO－1诱导剂组在肺泡和支气管上皮细胞表达明显增强。
2.2 肺组织形态学观察
2.3 肺组织湿／干重比和肺泡损伤率
与假手术组比较，各组肺组织湿／干重比和肺泡损伤率显著升高(p 量红细胞及血性液体渗出，并伴有局部肺不张：HO-1诱导剂组炎性细胞浸润明显减轻，肺泡出血减少。剂则明显降低(P
