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戊型肝炎病毒( hepatitis E virus, HEV)是非甲非乙型急性肝炎的病原体之一,其传播方式主要经粪-口途径,也有报道可以通过口-鼻和血液传播。前苏联学者Balayan 等［1］1983 年首次用免疫电镜技术自1名志愿感染者粪便中检测到HEV颗粒。在1989 年的东京国际会议上, 该型肝炎及相关病毒分别被正式命名为戊型肝炎( hepatitis E, HE) 和戊型肝炎病毒(HEV)。HE在亚洲、非洲及美洲的墨西哥等发展中国家常呈爆发流行,我国1986 ―1988年在新疆曾经发生爆发流行［2］ ,在世界范围内呈散发传播［3］ 。人类为HEV易感群体,病人发病症状严重,病死率高,青壮年病死率可达1% ～2% ,远较其他各型肝炎高,孕妇的病死率可高达20%左右,HEV 对人类健康造成严重威胁。
1病原体
ICTV 第8 次报告建议将HEV 暂归为戊型肝炎病毒科(family Hepeviridae), 并为唯一的戊型肝炎病毒属(genus Hepevirus)成员(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTV)。 HEV是单股正链RNA病毒,无囊膜,表面有纤突,病毒粒子直径24～34 nm。该病毒内部呈现两种不同形态:一种内部密集,含遗传物质的，为完整病毒颗粒。另一种内部透亮,为不含完整基因的缺陷病毒颗粒。蔗糖梯度离心前者沉降系数为183 S,后者为165 S。病毒的浮密度在蔗糖溶液中为1.349 g/mL,在酒石酸钾溶液中为1.189 g/mL。
基于HEV核苷酸序列的系统进化分析，HEV可以分为4种不同的基因型，即基因1、2、3和4型。其中基因1型在世界范围内广泛流行，被认为只在人群中流行。2006年有研究报道在柬埔寨猪粪样中检测到基因1型HEV RNA［4］，但是其确切情况还有待进一步证实。基因2型HEV只在墨西哥和非洲少数地区人群中流行，迄今为止，还未在世界其他地区发现。基因3和4型被认为是人兽共患病病原体，其中3型在世界范围内的人群和猪群中流行，我国2007年首次在上海猪群中发现基因3型HEV感染［5］。1993年，基因4型首先在中国人群中被发现。除中国以外，基因4型还主要在日本、印度、印度尼西亚以及越南的猪群和人群中流行［6］。4种基因型HEV被认为只有一种血清型［7］。自2000年以来，4型HEV已经成为在中国流行的主要基因型［8］。
2基因组结构
图1显示了HEV基因1~3型和基因4型的基因组结构。研究数据表明,HEV基因组结构上不存在人和动物之间的差别。HEV整个基因组约为7.2 kb,分析来自各个区域的分离株基因组结构显示，HEV基因组含有3个相互重叠的阅读框。5’端含有帽子结构和一段28 bp的非编码区。3’端含有约68 bp的非编码区和Poly A结构。ORF-1主要编码与病毒RNA复制有关的非结构蛋白,具有甲基转移酶,木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶, RNA解旋酶, RNA依赖的RNA聚合酶的活性。ORF-2编码660氨基酸的结构蛋白, pORF 22蛋白因其具有良好的抗原性,是目前公认的最有应用前景的亚单位候选疫苗,已有许多ORF-2基因或其片段在不同细胞中成功地进行了表达,如原核细胞、昆虫细胞、酵母细胞、动物和植物细胞等［9］ ,且其表达产物均有良好的免疫原性。ORF-3含有369个碱基，其5’端和ORF-1 有1个碱基的重叠，其余大部分和ORF-2重叠。ORF-3所编码的产物为123个氨基酸残基的磷酸化蛋白［10］,目前为止还不是很清楚其主要功能。报道显示，基因4型在ORF-1下游有3个碱基缺失，从而导致基因4型的ORF-2和ORF-3编码基因短于其他毒株，分别编码659和122个氨基酸［11］。
3病毒的宿主范围与增殖
最近越来越多的报道显示,HE是人兽共患疾病。人是HEV的天然宿主，但是动物却作为HEV的天然寄主，从而扩增病毒以感染人类。已经有几种灵长类动物被证实对HEV易感，包括绢毛猴、食蟹猴、猕猴、 猫头鹰猴、黑猩猩、非洲绿猴、豚尾猴［12~14］。其中猕猴已经被认为是用于研究HEV最有价值的模式动物，因为它能很好地模拟HEV感染后的各种症状。实验室研究表明，灵长类动物感染HEV后的发病过程和人类相似，只是病毒粒子在体内持续时间上稍有区别［12,14,15］。许多报道表明，在自然状态下家养的猪、羊、及其野鹿可以被HEV感染，而且在实验室中，这些物种也可以实验感染HEV［16~19］。多种检测及研究手段在人类及动物中检测HEV结果均支持HE是一种人兽共患病［16］。分离自美国猪的1株HEV毒株已经在实验室证实可以感染灵长类动物［20,21］。而且系统进化分析表明该株HEV在核苷酸序列水平上和美国分离自人类的HEV高度同源，却与墨西哥分离株及缅甸分离株有很大分歧。来自世界不同地区越来越多的证据证实HE是人兽共患病，包括新西兰、日本、荷兰、加拿大、中国大陆及台湾地区。近来，一种新的类似于哺乳动物HEV的病毒从美国鸡的胆汁中分离出来［22］，血清流行病学及病毒异质性研究显示，禽类HEV在美国鸡群中广泛流行［23］。更近的一项报道发现了HEV从鹿直接传染给人的证据［24］，而HEV从其他动物传染至人的事件也已有大量报道。其中基因3型的人兽共患主要发生于美国、欧洲和日本；基因4型HEV 的人兽跨种传播主要发生于日本，中国大陆和台湾地区。基因1和2型至今还没有在动物中发现，是否他们不以动物作为宿主还有待于进一步研究。
4流行模式与地理分布
HEV在世界范围内以散发和局部流行区爆发式流行。世界上第一次HE爆发发生在1955―1956年印度的德里地区，该次爆发由自来水加氯不完善引起，有2.9万人感染［25］。自此以后，HE的主要爆发事件时有发生(表1)。在HE爆发期间，15~40岁成年人感染率最高，为1%~15%［26］。但也有报道显示儿童对HEV比成人更易感［27,28］。在爆发期间，HEV致死率为0.2%~4%，但是至今还令人迷惑的是，有10%~20%感染HEV的孕妇发生急性肝衰，特别是在妊娠第三期［29，30］。
世界上报道的HEV流行区域分布见图2，图中显示的为本土HEV流行，伊拉克的流行情况有待于进一步证实［31］。
5HE与怀孕
报道显示，怀孕处于妊娠三期的妇女感染HEV后死亡率高达20%［29］，研究认为HEV会导致怀孕妇女子宫内感染从而会引起产前发病和死亡［32］，而且死亡常由脑部疾病、出血性素质或肾衰竭引起。有研究者给食蟹猴静脉注射感染HEV，发现食蟹猴出现急性肾小管坏死并伴有出血，说明HEV在肾中复制［33］。然而以灵长类动物模型研究怀孕与HEV的关系时，却发现怀孕的猴子并不比未怀孕的猴子死亡率高［34，35］。研究已经清楚阐明怀孕妇女HEV感染在血管内出现高度的沉积物，但是HEV流行区的散发型孕妇病例却并不像爆发时期死亡率那么高，仍然有待于进一步研究。我国新疆1986 ―1988年爆发HE，死亡人数高达707人，其中有414名孕妇，而且孕妇患HEV的死亡率远高于该地区的正常人群及其他地区的HEV散发群体。该特征也在印度HE爆发案例中存在，其具体机制有待进一步研究，推测与病毒的基因型，地区人们的生活习惯及爆发和散发时病毒的剂量差异有一定的关系。
6检测方法
6.1病毒抗原的检测
利用免疫电镜(IEM)技术可以检测出潜伏期和急性期的HE病人或实验感染动物的粪便及胆汁标本中的HEV颗粒。标记的抗-HEV抗体可以检测到肝细胞组织中的HEV 特异性抗原。利用Western 印记法可检测出病人血清中的抗HEV IgM 和IgG 抗体。Meng等在PCR基础上建立了快速血清中和试验(rSNA) 方法。
6.2病毒抗体的检测
酶联免疫吸附实验( ELISA) 是目前用于检测血清HEV 抗体最常用的方法, 其中以间接ELISA用途最广。用于检测HEV的抗原有组织培养全病毒抗原、合成肽抗原和表达抗原。1991 年美国Grenelabs公司以HEV墨西哥株和缅甸株ORF-3区的一段重组表达多肽为抗原, 首次研制出第一代抗HEV ELISA试剂盒。不久即被Shidmore利用Yarbough构建的ORF-2和ORF-3两个克隆的表达产物作抗原建立的第二代ELISA方法所代替, 第三代检测试剂为真核表达系统产物。不同类型组合的抗原其敏感性和特异性不同。Mast等比较了12种不同组合的重组抗原和合成肽抗原, 血清抗体检测结果发现, 不论是昆虫细胞表达的还是大肠杆菌表达的ORF-2或ORF-2+ORF-3的重组蛋白均表现出较高的敏感性(83%~98%)和特异性(93%~100%), 而合成肽的敏感性(15%~57%)要远远低于重组蛋白, 但特异性仍很高(84%~100%)。毕胜利等利用大肠杆菌表达了ORF-3、ORF-2及ORF( 2+3)嵌合蛋白, 利用这些表达蛋白作ELISA试验, 并与新加坡标准HEV酶标检测试剂盒结果进行比较, 结果显示, 嵌合抗原与标准试剂盒的阳性符合率最高, 且P/N值也很高, 利于结果判断, ORF-3抗原的阳性符合率略高于单独的ORF-2抗原。通过对新基因型抗原性研究发现, 不同基因型的表达抗原在检测HEV抗体时表现出不同的敏感性。Kwo和Schlauder等分别发现感染HEV 2~4型的病人对用1、2 型多肽作为抗原的诊断试剂缺乏IgG或IgM的反应性。王佑春［36］研究小组利用1型和4型ORF-3全长和ORF-2的414~672 位置259 个aa 表达抗原检测了91 例临床诊断为HE患者的血清, 结果HEV 1型和4型ORF-3分别检出51例和71例,ORF-2片段分别检出50例和61例, 差异有统计学意义。何志强等建立了以单基因型HEV重组蛋白为抗原的检测HEV的DS-ELISA, 并检测了不同动物的HEV抗体。孟继鸿等［37］将7种重组蛋白等量混合后作为抗原, 检测动物血清HEV抗体, 研究证实, 适用于在各种动物中进行血清流行病学调查, 敏感性高,特异性好。这些结果提示，用不同基因型的表达蛋白检测HEV抗体时，会造成临床上的误诊, 在作血清流行病学调查时也会有不同的结果。
6.3病毒RNA的检测
RT-nPCR法是目前检测病毒RNA的常用方法，有很高的敏感度和特异性。在基因3、4型未确定之前, PCR引物是根据HEV 1型的序列设计的, 该引物扩增1型的特异性很好, 但不能有效扩增其他基因型。中国也是利用兼并引物扩增的方法, 发现了基因4 型。葛胜祥等［38］针对国内流行的HEV 基因1、4型,在这两型序列的保守区域设计了一套RT-nPCR引物, 检测结果初步表明, 对于在国内流行的基因1、4型HEV, 该引物的检测灵敏度要高于目前常用的通用引物。
7疫苗的研制
对HE的预防, 除采取切断传播途径的措施外，应用疫苗是根本手段。由于没有成熟的HEV细胞培养系统,现阶段研制弱毒或灭活苗还不太现实,因此,只能发展核酸疫苗或基因工程苗技术。ORF-2编码的衣壳蛋白是病毒粒子的主要结构蛋白,所以疫苗研究主要针对该蛋白。实验证明,ORF-2具有较好的免疫原性,针对ORF-2的抗体可以在体外中和病毒。现已有许多ORF-2基因或其片段在不同细胞中成功地进行了表达, 如原核细胞、昆虫细胞、酵母细胞、动物和植物细胞等, 且其表达产物均有良好的免疫原性。在美国, 一种用杆状病毒表达的55 kD的重组壳蛋白疫苗首先通过Ⅰ期临床试验, 目前此疫苗正在尼泊尔进行Ⅱ和Ⅲ期临床试验。在中国, 厦门大学和北京万泰生物药业有限公司研制出中国第一种拥有核心自主知识产权的基因工程疫苗―重组戊型肝炎疫苗,目前正式获准进入I/II 期临床试验。该疫苗有望成为继乙肝疫苗之后, 世界上第二个基因工程病毒疫苗。HEV DNA 疫苗的研究还处于起步阶段，He 等学者初步探讨了HEV DNA 疫苗的免疫效力和机制，Tuteja 等则探讨了细胞因子对DNA 疫苗佐剂作用,为开发实用化、低成本的HEV 核酸疫苗打下基础。但是DNA 疫苗制备和免疫仍然比较复杂,如何发展简便易行的核酸疫苗免疫载体系统,使核酸疫苗的免疫制备和免疫更加简便,已成为其市场化的主要瓶颈之一。
虽然有效的HEV 疫苗的研制已取得很大的进展，但目前人们仍然应该注意有效预防HEV的措施。首先是加强水源管理，合理处置人畜粪便，严防水源及食品被粪便污染， 改善供水条件，保证安全用水。广泛宣传喝开水，不喝生水。其次应改善卫生设施，提高环境卫生水平，加强食品卫生监督和养成良好的个人卫生习惯。
总之，HE是一种新出现的人畜共患病,猪作为HEV最主要的自然宿主,随着人们生活水平的提高,其公共卫生意义将越来越受到重视, HEV可能成为畜产品国际贸易检测的重要指标。虽然各国已经对HEV进行了深入的研究,但仍有许多问题尚未解决,例如细胞培养方面需要寻找敏感细胞系并探索适当的培养条件;尚需寻求新的表达系统以用于研制HE疫苗;越来越多的动物被发现易感HEV,所以在预防控制等方面会变得更加困难。但是随着分子生物学的发展,研制和开发HEV的基因疫苗具有广阔的前景,HE也会在不久的将来得到有效的控制。
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