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【摘 要】目的建立反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定虫草制剂中腺苷和尿苷含量的方法。方法采用水浴温浸和加热回流的方法,制备供试品溶液。色谱柱为Hypersil C18柱(200 mm×4.6 mm)流动相为pH 6.5磷酸盐缓冲液∶甲醇(85∶15),检测波长为260 nm。结果方法的平均加样回收率:腺苷为98.9%,RSD为1.4%(n=6);尿苷为97.9%,RSD为1.5%(n=5),腺苷在23.2～928.0 mg/L范围内线性关系良好,尿苷在16.0～640.0 mg/L范围内线性关系良好。结论此方法简便、准确,重现性好,可作为判定虫草制剂质量的一种方法。
【关键词】冬虫夏草;金水宝胶囊;至灵胶囊;宁心宝胶囊;反相高效液相色谱法;核苷类化合物
冬虫夏草(Cordyceps sinensis)是滋补强壮的名贵中药,具有补虚损,益精气,补肺益肾,止咳,化痰,止血,滋阴壮阳,阴阳并补等功效,临床上广泛应用于急、慢性支气管炎、支气管哮喘、肺气肿等,疗效卓著,其所含的核苷类成分为其有效成分之一,其中腺苷具有改善心脑血液循环[1]、防止心律失常[2]、抑制神经递质释放和调节腺苷酸环化酶活性[3]等作用,已被用作冬虫夏草的质控指标[4]。但由于天然冬虫夏草对生长环境有特殊的要求,故自然资源极其匮乏。近年来研究人员从天然冬虫夏草中分离出来的虫草真菌,经培养、发酵得到人工培养菌丝体[5-6],为药源紧缺的天然冬虫夏草开辟出新的有效的药源,已开发出金水宝胶囊、至灵胶囊和宁心宝胶囊等多种虫草制剂。本实验拟采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)对其中核苷类成分同时测定分析,以达到质量综合评价的目的。实验结果表明,两种核苷类成分在同一色谱条件下均得到较好分离,并可进行含量测定。该方法样品预处理简便,回收率高,易于操作。
1仪器和药品
1.1仪器高效液相色谱仪(美国Waters公司);Waters 510输液泵(美国Waters公司);U6K进样阀;Waters 484型紫外检测器;Base 810色谱工作站(美国Waters公司);Hamilton微量进样器(瑞士Bonaduz公司)。
1.2药品金水宝胶囊(江西金水宝制药有限公司,批号20020207);至灵胶囊(大同市利群药业有限责任公司,批号20011206);宁心宝胶囊(正大青春宝药业有限公司,批号0511003);腺苷(美国SIGMA公司);水为重蒸水;尿苷(中国药品生物制品检定所,批号887-200001);甲醇、乙醇为色谱纯,其他试剂均为分析纯。
2方法和结果
2.1色谱条件色谱柱:Hypersil C18柱(200 mm×4.6 mm);流动相:pH 6.5磷酸盐缓冲液∶甲醇(85∶15);流速:0.9 mL/min;检测波长:260 nm;柱温:室温;灵敏度:0.02 AUFS;进样量:10 μL。
2.2对照品溶液的制备分别精密称取60℃干燥至恒重的对照品腺苷5.80 mg和尿苷4.00 mg置同一量瓶中,加50%乙醇溶解定容至5 mL作为对照品溶液。
2.3标准曲线的绘制分别取对照品溶液各1.0 mL,混合均匀,0.45 μm 的微孔滤膜滤过,置于5 mL容量瓶中,50%乙醇定容,精密吸取0.1 μL、0.5 μL、1.0 μL、2.0 μL、4.0 μL的标准品溶液。在上述色谱条件下,分别进行测定。结果(图1 A),以浓度为横坐标(C,mg/L),峰面积(A)为纵坐标,绘出标准曲线,得回归方程。回归方程腺苷A=18.012C-0.023 5;线性范围23.2～928.0 mg/L
(r =0.999 8);尿苷A=36.329C-0.002 7;线性范围16.0～640.0 mg/L(r =0.999 6)。
2.4供试液的制备取金水宝胶囊、宁心宝胶囊和至灵胶囊中药物粉末,分别编号并精密称取500 mg,加入20%乙醇50 mL,温浸14 h后,超声处理30 min,滤过,滤液减压浓缩至干,残留物用50%乙醇溶解,转移至5 mL量瓶中,临用前经0.45 μm微孔滤膜过滤,定容至刻度。
2.5精密度试验取同一浓度的对照品溶液,重复进样5次,进样量10 μL,测得腺苷和尿苷标准品保留时间及峰面积的RSD分别为1.43%、1.36%;1.27%、1.50%。
2.6重现性试验按照拟订的方法处理5份样品,在拟订的色谱条件下进行测定,测得腺苷和尿苷的RSD分别为1.41%、1.86%。
2.7样品测定取金水宝胶囊、至灵胶囊和宁心宝胶囊,3种样品按2.4项下制备供试液,在2.1项下每个样品重复测定3次,测定结果(表1),色谱图(图1)。
2.8加样回收试验精密量取已知含量的同一批号宁心宝胶囊样品6份,每份5 mL按样品浓度的60%加入腺苷和尿苷的标准品溶液,按照拟订的方法进行处理。在确定的色谱条件下测定含量,计算回收率。结果(表2)。
3讨论
1)3种不同虫草制剂的核苷类化合物的含量差别较大的原因可能主要是由于发酵使用的菌种不同所致,此外,发酵培养基的组分不同和培养条件不同也是导致其含量不同的原因之一。故菌丝生产中菌种的继代和保存以及保藏及培养条件的均一性非常重要。
2)本方法具有样品预处理简单,回收率高,重现性好等特点。
