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【摘要】目的:研究结肠癌患者外周血血管紧张素转换酶(ACE)基因多态性分布规律。方法:30例患者为研究组,30例正常人为对照组,采用聚合酶链反应(PCR),对入组的结肠癌患者外周血中ACE基因表达进行检测,以了解ACE基因插入型(ID型)、缺失型(DD型)和Ⅱ型3种基因型及I/D等位基因在结肠癌患者外周血中的分布规律,并进行统计学处理。结果:结肠癌患者外周血ACE基因插入/缺失(I/D)多态性分布:ID型、DD型和Ⅱ型3种基因型的占比分别为36.67%、6.67%、56.66%,I/D等位基因分布频率分别为53.30%和46.70%,对照组ID型、DD型和Ⅱ型3种基因型的占比分别为53.33%、16.67%、30.00%,I/D等位基因分布频率分别为43.33%和56.67%,两组间基因型分布频率和I/D等位基因分布频率均有显著差异(p70岁者;④原发性高血压病患者;⑤合并严重心、脑、肾、血液系统疾病患者;⑥精神病患者;⑦不愿意接受本研究措施者。
1.2患者情况年龄40-70周岁,其中男性18例,女性12例,临床分期Ⅰ-Ⅱ期者17例,Ⅲ-Ⅳ期者13例,结肠腺癌1例,结肠中分化腺癌10例,结肠中低分化腺癌3例,结肠乳头状腺癌2例,结肠溃疡性中分化腺癌2例,结肠粘膜浸润性腺癌1例,结肠中分化粘液腺癌1例,结肠低分化腺癌2例,结肠管状腺癌2例,结肠中分化管状腺癌6例。研究组与对照组除结肠癌外,在一般情况方面比较均无显著差异(p>0.05)。
1.3DNA提取采用蛋白酶K消化酚-氯仿抽提法。
1.4引物合成和PCR扩增引物由上海生工合成,序列如下:
ACE-Ⅰ-upper:5"-GCCCTGCAGGTGTCTGCAGCATGT-3"
ACE-Ⅰ-down:5"-GGATGGCTCTCCCCGCCTTGTCTC-3"
扩增片段大小,插入型为597bp,缺失型为319bp。PCR扩增体系体积为25µl,反应体系含Taq酶1.0µl,10×buffer2.5µl,10mMdNTP0.5µl,引物(10pmol/µl)各0.5µl,模板gDNA约100ng。扩增条件:94℃预变性5分钟,然后94℃30”,56℃45”,72℃1分钟,共35个循环;最后72℃5分钟。试剂均购自Takara公司。对于基因型为缺失型纯合子(DD)型的个体再用特异性扩增插入片段的ACE-Ⅱ进行验证,如扩增出目的片段则为ID型。ACE-Ⅱ引物序列如下:
ACE-Ⅱ-upper:5"-TGGGACCACAGCGCCCGCCACTAC-3"
ACE-Ⅱ-down:5"-TCGCCAGCCCTCCCATGCCCATAA-3"
扩增片段大小为335bp,退火温度为65℃,反应条件同ACE-Ⅰ。
1.5PCR产物检测PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳约30分钟,电压100v,在紫外灯下观察条带。Marker为DL2000。
1.6统计学处理采用SPSS12.0统计软件,组间频率比较采用X2检验,以p
