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【摘要】 目的 观察乌司他丁注射液对脓毒症大鼠肺微血管通透性及肺组织血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响,探讨乌司他丁对脓毒症大鼠肺保护的作用机制。方法 30只健康的雄性SD大鼠随机分为3组:假手术组(A组)、阳性对照组(B组)、乌司他丁治疗组(C组),每组10例。除假手术组外,其他组均施行盲肠结扎穿孔术(CLP)复制大鼠脓毒症模型,治疗组同时给予乌司他丁腹腔注射(100 ku/kg),术后4 h随机处死大鼠5只取组织标本,剩余5只大鼠经颈外静脉注射伊文思蓝观察肺微血管通透性。分别采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和酶联免疫吸附(ELISA)法检测肺组织中VEGF的表达。结果 B组肺微血管通透性及肺组织VEGF表达水平明显高于A、C组;C组肺微血管通透性及肺组织VEGF表达水平高于A组(P 1.4 检测肺组织VEGF mRNA表达 采用RT- PCR技术检测。取肺组织100 mg置碾钵中用液氮制备肺组织匀浆,采用Trizol(Sigma公司)一步法提取肺组织总RNA。采用两步法RT-PCR试剂盒(Invitrogen公司)进行RT-PCR, 以GAPDH作为内参照,以10μl扩增产物经质量分数115%琼脂糖凝胶电泳后,用LabWork 410 UVP成像系统照相并分析结果。以目的基因与内参照在凝胶上的灰度值比值为基因表达的相对含量。大鼠VEGF序列(扩增片段为578bp):上游5′-ATG AAC TTT CTG CTG TCT TG-3′,下游5′-TCA CCG CCT CGG CTT GTC A-3′;大鼠GAPDH系列(扩增片段500bp):上游5′-TCC ATG ACA ACT TTG GTA TCG T-3′;下游5′-GTG GGC CAT GAG GTC CAC-3′。PCR反应条件: 94℃ 5 min预变性, 94℃ 40s变性, 56℃ 45 s退火, 72℃ 55 s延伸,共计32个循环, 72℃ 10 min延伸。RT-PCR操作严格按照说明书进行。
1.5 测肺组织VEGF蛋白表达 采用ELISA法检测。严格按照大鼠血管内皮生长因子ELISA试剂盒(武汉中美科技有限公司)说明书操作,酶标仪(BIO-RAD680)波长450 nm下读取吸光度,根据标准曲线得出VEGF浓度。
1.6 肺微血管通透性的测定 ①伊文思蓝含量测定法:按20 mg/kg经左侧颈外静脉注射2%伊文思蓝液(北京恒业中远化工有限公司),半小时后将动物麻醉开胸取部分左肺,剪去周围组织,吸干表面水分及血液,称量湿质量,将肺组织剪成约10 mm�3小块浸泡于甲酰胺溶液中(0.2 g/Kg),置60℃恒温水浴中抽提24 h,待组织中色素全部浸出,取出组织,离心,取上清液,在与标准曲线相同的条件下,用紫外分光光度计(岛津2000)在620nm波长处进行比色测定光密度值,在标准曲线上查出EB含量,以每克肺组织干重含EB质量表示;②湿/干质量比测定:称肺组织湿质量后,置烤箱80℃,72 h,称干质量,计算湿/干质量比值。
1.7 统计学方法 采用SAS v8.1统计软件包对所得资料进行统计分析。计量资料采用SNK-q检验,P
