【www.zhangdahai.com--爱岗敬业演讲稿】
[摘要]目的 探讨应用过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)激动剂环格列酮减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的作用及其量效关系。方法70只健康sD大鼠建立心肌缺血再灌注模型后，随机分成假手术组(S组)、缺血再灌注组(I／R组)、环格列酮组1(cigl组)、环格列酮组2(cig2组)、环格列酮组3(cig3组)，每组14只。各组中又随机分为两个亚组。亚组l(6只)在缺血30min、再灌注120min后，以Evans blue、NBT双重染色法测定心肌梗死面积；亚组2(8只)以生物信号分析系统监测记录缺血1、30min，再灌注后1、30、60、90、120min各时间点的左室舒张末压(LVEDP)、左室内压(LVSP)及左室内压发展最大速率(±dp／dt)等血流动力学指标。实验结束时取心肌组织，光镜下观察心肌组织损伤情况，免疫组化法检测心肌组织中细胞间黏附分子-1(ICAM-1)蛋白表达，酶联免疫吸附法(ELISA)测定心肌组织细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的含量，比色法测定心肌组织髓过氧化物酶(MPO)活性。结果与S组比较，I／R组大鼠心肌梗死面积增大，心肌MPO活性升高、中性粒细胞(PMN)浸润严重，心肌细胞因子TNF-α、IL-6含量明显增多，心肌组织高表达ICAM-1(均P-1；(2)缺血再灌注组(I／R组)，结扎左冠状动脉前降支(LAD)前1h经颈内静脉推注10％DMSO 1ml・kg-1；(3)环格列酮组1(cigl组)，结扎LAD前1h经颈内静脉推注环格列酮0.3mg・kg-1；(4)环格列酮组2(cig2组)，结扎LAD前1h经颈内静脉推注环格列酮1mg・kg-1；(5)环格列酮组3(cig3组)，结扎LAD前1h经颈内静脉推注环格列酮3mg・kg-1。各组内再随机分成两个亚组，亚组1的6只大鼠用于心肌梗死面积测定；亚组2的8只大鼠用于监测血流动力学指标，并于再灌注120min后取心肌作各种检测。
各组大鼠用戊巴比妥钠(40mg・kg-1)腹腔麻醉，股静脉为给药及维持输液通道。颈部气管切开插管，接小动物呼吸机，机械通气维持呼吸。胸骨正中切口，I／R组及cigl、2、3组以7-0线在LAD根部穿线，在LAD上垫一塑料管一同结扎，缺血30min后剪断结扎线，再灌注120min。建模成功以结扎LAD后Ⅱ导联融合的ST-T抬高恢复再灌注后下降1／2以上为标志。假手术组仅在LAD下穿线不结扎，旷置150min。
1．2．2 心肌梗死面积测定各组亚组1的大鼠经30min缺血和120 min再灌注后重新结扎LAD，将质量分数为1％的Evans blue经主动脉注入，以区分缺血区和非缺血区。处死动物，剪去大血管、心房及右心室，将左心室沿心脏长轴均匀切成2 mm的薄片，切片浸入0.5％的NBT磷酸缓冲液中(pH值7.4)，并于37℃水浴箱孵育30min，以区分缺血区和梗死区，然后用10％的甲醛固定24h以增强染色颜色对比。经以上处理，蓝色是正常心肌，粉红色是缺血心肌，灰白色是坏死心肌。在解剖显微镜下小心将不同染色区分离。将左室、缺血区、梗死区分别用电子天平称重，以梗死区重量(NEC)／缺血区重量(AAR)来表示梗死程度(％)，以缺血区重量(AAR)／左室重量(LV)表示缺血程度(％)。
1．2．3 血流动力学指标的测定各组亚组2的大鼠经颈动脉插管至左心室，以生物信号分析系统监测记录左室舒张末压(LVEDP)、左室内压(LVSP)及左室内压发展最大速率(±dp／dt)等血流动力学指标。在缺血1、30min，再灌注1、30、60、90、120min 7个时间点观察相应血流动力学指标。
1．2．4 心肌组织匀浆液中细胞因子TNF-α、IL-6的测定再灌注120min后处死大鼠，取缺血区心肌组织， 用4℃ 0.9％生理盐水反复漂洗后剪碎，冰浴匀浆，以4℃．9％生理盐水为匀浆介质制成10％心肌组织匀浆，4℃ 3000r・min-1离心10min，留取上清液置-80℃冰箱保存，待所有取材结束后，ELISA测定TNF-α、IL-6。
1．2．5 组织学检查取心尖部心肌组织，10％甲醛固定后石蜡切片，行H-E染色光镜检查。
1．2．6 ICAM-1蛋白表达检测 心肌石蜡标本以4μm厚切片，按免疫组化SABC法染色，封片镜检，棕黄色颗粒为阳性。OLYPUSE 400倍镜下，准确定位所测视野，由HPIAS 2000高清晰度彩色病理图像分析系统进行处理，每标本随机选取8个不重叠的视野，测定免疫组化反应阳性颗粒的平均光密度值(OD)，半定量分析ICAM-1表达。
1．2．7 MPO含量检测准确称取心肌组织重量，按重量体积比为1:19加匀浆介质制成5％的心肌组织匀浆。吸取上清液于-20℃冰箱保存。测定在460nm处的OD值。每克组织湿片在37℃的反应体系中H2O2被分解为1μmol为1个酶活力单位。
1．3 统计学处理
采用SPSS10.0统计软件，实验数据以x±s表示，组间比较用单因素方差分析(one-way ANOVA)，P0.05)。见表1。
2．2 心肌组织MPO活性的测定
I／R、cig1、cig2、cig3组MPO活性均较s组明显增加(JP0.5)。见表1。
2．3 心肌组织形态学观察
光镜下可见，s组心肌结构正常，细胞界限清晰，无明显水肿及炎性细胞浸润；I／R组心肌水肿严重，细胞界限不清，心肌细胞出现颗粒变性、空泡变性，胞浆疏松透明，炎性细胞浸润，血管充血，有红细胞渗出，心肌纤维排列不规则，结构紊乱；cig各组心肌轻度水肿，细胞界限清楚，炎性细胞散在浸润，心肌纤维排列及结构较清楚。
2．4 心肌梗死面积测定
各组AAR／LV数据比较差异无统计学意义，说明各组缺血危险程度具有可比性，各组缺血面积比例基本一致。与s组比较，I／R组、cig各组的NEC／AAR比值明显升高(P0.05)。见表3。
2．6 环格列酮对模型大鼠心功能的影响
I／R组以及cig各组，结扎LAD引起心肌缺血后，LVSP、+dp／df、-dp／dt均明显下降，恢复灌注后上述指标进一步降低，再反弹到一较高值，然后又逐渐下降，到再灌注2h，上述指标仍存在下降趋势。与I／R组比较，cig1、cig2、cig3组再灌注90、120min LVSP明显升高(P0.05)。见表4。
3 讨论
MIRI的主要表现为心肌炎性反应，心肌细胞凋亡、坏死，心功能下降以及心律失常等，其机制相当复杂，是多种因素交互作用的结果。一般认为氧自由基、钙超载及中性粒细胞(PMN)浸润起着决定作用，且这些作用与细胞因子密切相关。以PMN浸润为主的炎症反应是造成MIRI的重要因素之一。炎症反应在心肌缺血阶段即被激活，再灌注则明显加剧了心肌的炎症反应。MPO是PMN的标志酶，其活性高低可以反映组织中PMN的浸润程度。本研究发现心肌IR时MPO活性明显升高，缺血心肌组织HE切片可见大量PMN浸润，存在明显的炎症损害。用PPAR-γ激动剂环格列酮干预后，心肌MPO活性明显下降，PMN浸润程度减轻，提示环格列酮可通过抑制心肌内PMN浸润、减轻炎症反应来拮抗MIRI。ICAM-1在MIRI中起着重要作用，本研究表明IR后心肌ICAM=-1表达明显增高。而ICAM-1的高表达可刺激PMN与内皮细胞黏附，介导其对心肌细胞的浸润，引起并加剧心肌细胞的损伤，导致细胞死亡。Niessen等研究认为急性心肌梗死(AMI)心肌细胞中ICAM-1高表达，若抑制其表达，可减小梗死面积。本实验通过预先使用不同剂量的PPAR-T激动剂环格列酮对心肌IR进行干预，发现心肌ICAM-1表达明显降低，并可减小心肌梗死面积，改善心脏舒缩功能。提示PPAR-T激动剂环格列酮可通过降低ICAM-1的表达起到心肌保护作用。
许多实验研究证实，细胞因子尤其是TNF-α、IL-6作为重要的炎性介质在MIRI的病理生理过程中起着重要的作用。TNF-α是炎症级联的始发因子，可激活PMN，释放弹性蛋白酶和氧自由基等，并使炎症信号产生级联放大作用，直接损伤内皮细胞，使毛细血管通透性增高。。IL-6为白细胞和内皮细胞产生的重要炎性介质之一，处于炎症调控的枢纽位置。IL-6大量产生可诱导PMN进入缺血区，刺激黏附分子CDllb／CD18、ICAM-1的表达，介导PMN与心肌细胞结合，致使缺血 心肌损伤加重。本实验结果表明，与假手术组比较，缺血再灌注组心肌TNF-κ、IL-6含量明显升高(P-1)干预心肌缺血再灌注未得到与相应剂量等价的保护效果。不同剂量的环格列酮在减少心肌梗死面积、改善心功能、减少PMN浸润程度、抑制心肌ICAM-1的表达以及降低心肌促炎因子TNF-α、IL-6的水平等方面无明显差异，提示PPAR-γ激动剂环格列酮对心肌IR的保护作用无明显量效关系。其原因可能与本实验样本量过少、所用的环格列酮剂量划分不够细化以及实验时间过短有关。
本研究结果表明，PPAR-γ激动剂环格列酮可以明显减少心肌IR时的心肌梗死面积，改善心脏舒缩功能，减少PMN浸润，降低心肌促炎细胞因子TNF-α、IL-6的含量，抑制心肌细胞间黏附因子ICAM―l的表达，从而起到保护心肌组织的作用。
