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[摘要]目的 研究COX-2基因沉默对人胃癌细胞系SGC-7901裸鼠成瘤的影响。方法构建靶向COX-2的短发夹状双链RNA(shRNA)的真核表达质粒转染人胃癌细胞系SGC-7901，采用RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果。15只裸鼠随机分为3组，每组5只，皮下接种胃癌细胞。抑制组：接种转染抑制质粒的胃癌细胞；正常对照组：接种未转染的胃癌细胞；阴性对照组：接种转染阴性对照质粒的胃癌细胞。接种4周后比较各组裸鼠皮下形成瘤体的大体和病理情况并计算抑瘤率。结果转染靶向COX-2的shRNA抑制质粒后细胞中COX-2的表达被明显抑制，抑制率为70.42％。正常对照组和阴性对照组所有裸鼠均有瘤体形成，平均瘤质量分别为(0.49±0.017)g和(0.49±0.013)g。抑制组仅2只有瘤体形成，平均瘤质量(0.05*0.003)g，与正常对照组相比差别有统计学意义(P2、相对湿度为90％的培养箱中培养。待细胞汇片基本铺满瓶底时传代。
1．2．2 细胞转染。将人胃癌细胞系SGC-7901接种于六孔板中，每孔加入含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基2ml。置二氧化碳培养箱中培养(37℃，5％CO2)，隔日更换培养液。待细胞汇片至80％时，用无血清RPMI 1640培养基洗3遍。将质粒和阳离子脂质体按照每1μg质粒加入5μl脂质体的比例混合于无血清RPMI 1640培养基中，室温静置15min，然后均匀滴加入六孔板，每孔200μl。3h后更换为含血清培养基，48h后荧光显微镜下观察转染情况。
1．2．3 抑制效果检测。采用RT-PCR和Western blot两种方法分别检测细胞中COX-2 mRNA和蛋白质含量。实验分3组，分别为转染质粒WBHI的细胞组、转染阴性对照质粒HK的细胞组和未转染细胞组。用常规RT-PCR法扩增各组细胞中的COX-2 mRNA，β-actin作为内参照。COX-2上游引物为5′-TCAAGTCCCTGAGCATCTAC-3′，下游引物为5’一CATrCCTACCACCAGCAACC-3′，产物为488bp。β-actin上游引物为5-GAAACTACCTrCAACTCCATC-3′，下游引物为5′-CGAGGCCAGGATGGAGCCGCC-3′，产物219bp。94℃变性，55℃退火，72℃延伸，共35个循环。用细胞裂解液提取以上各组细胞的总蛋白，加热变性后10％SDS-PAGE电泳分离，电转移至PVDF膜上，用含5％脱脂奶粉的Tris盐溶液封闭2h，加入COX-2羊抗人多克隆一抗(1:200)，4℃孵育过夜。用含吐温-20的Tris盐溶液洗膜(3次，每次10min)后加入辣根过氧化物酶标记的兔抗羊二抗(1:2000)，室温下孵育1h。化学发光法(ECL)检测条带。actin作为内参照。以上实验均重复超过3次。
1．2．4 裸鼠成瘤实验。转染48h后收获细胞，制成细胞悬液，流式细胞仪(FAC Soa-BD，USA)分选纯化。冷PBS洗涤，0.4％台盼蓝染色，记数活细胞数；当活细胞比率>95％，调整细胞浓度至4×106个・m-1，按每只裸鼠0.2ml腹股沟皮下接种。15只裸鼠随机分为3组，分别接种转染WBHI质粒细胞(抑制组)、转染阴性对照质粒HK细胞(阴性对照组)和未转染细胞(正常对照组)，每组5只。实验过程均在SPF屏障环境内进行。接种4周后，观察各组裸鼠成瘤情况，比较成瘤率。断颈处死裸鼠，从皮下完整剥离取出肿瘤组织，比较各组裸鼠瘤体的大小和瘤质量。按下列公式计算抑瘤率：抑瘤率(％)：(正常对照组平均瘤质量一抑制组平均瘤质量)／正常对照组平均瘤质量×100％。将瘤组织切片，苏木精―伊红(HE)染色，光镜下观察病理形态。
1．2．5 统计学处理，采用SPSS13.0统计软件，运用 Oneway-ANOVA方法进行单因素多组间差异的比较，运用t检验进行两组间比较。P0.05)(图3)。
2．3 COX-2蛋白的抑制情况
COX-2蛋白在SDS-PAGE凝胶电泳中表现为72kD和74kD两条条带(图4)。转染了WBHI质粒的细胞中COX-2蛋白的表达明显受到抑制，结果与RT-PCR结果一致。
2．4裸鼠成瘤情况
接种4周后正常对照组5只裸鼠均有瘤体形成，成瘤率100％，平均瘤质量(0.49±0.017)g，阴性对照组成瘤率也为100％，平均瘤质量(0.49±0.013)g，与正常对照组相比没有统计学差异(P=0.965)。抑制组只有2只裸鼠有瘤体形成，成瘤率仅为40％(2／5)，平均瘤质量(０.05±0.003)g，与正常对照组相比有统计学差异(P
