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【摘要】 目的 观察基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)对体外培养的大鼠骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)动员和增殖的影响。方法 微孔法获取大鼠骨髓EPCs并采用荧光显微镜和流式细胞术鉴定EPCs特异性标记物。不同浓度SDF-1α处理EPCs后，采用细胞培养、MTT检测EPCs的克隆形成、细胞增殖。结果 通过MTT法检测，对照组与(1、10、100 μg/L)SDF-1α处理组的OD值分别为0．311±0．054、0．587±0．072、0．813±0．056、1．029±0．078，通过统计学方法分析，对照组与SDF-1α处理组比较差异均有统计学意义(n=5， P[1-3]。CXCR4为SDF-1的唯一生理配体，与SDF-1特异性的结合并引起细胞多种生物学功能改变[4-9]。研究表明，SDF-1参与造血祖细胞的归巢、细胞的迁徙与增殖、细胞的形成与发展、刺激免疫反应，促进恶性肿瘤血管形成及转移、促进血管新生[10]。�
内皮祖细胞(endothelial progenitor cells， EPCs)主要来源于骨髓，也存在于外周血、脐血、脾等组织， 在血管受损后血管内皮重新内皮化(reendothelialization)，组织缺血后血管新生以及包裹血管移植物中起重要作用。但循环EPC数目非常低，急性心血管疾病或伴有冠心病危险因素的病人数目更低，而且EPC迁移功能受损。研究发现，循环EPC数目与冠心病危险因素呈负相关[11]。故从分子水平研究调控EPC生物学特性基因对心血管疾病干细胞治疗有着重要的意义。本文旨在研究SDF-1α对EPCs的动员及增殖。
1 材料与方法
1．1 材料和试剂 4周龄左右雄性SD大鼠购自南华大学动物部；胎牛血清购自元亨圣马生物技术研究所；DMEM培养基购自Gibco公司；VEGF(Peprotech)；Murine SDF-1α(Peprotech)；明胶(sigma)；杂交瘤皿(Greiner bio-one)；其它试剂均为国产分析纯。
1．2 EPC分离与培养[12] 分离大鼠股骨和胫骨骨髓，采用杂交瘤皿培养分离内皮祖细胞集落单位细胞，荧光显微镜和流式细胞仪鉴定内皮祖细胞特异性标记物CD34/VEGFR-2/CD133，于普通培养皿用含有10 %小牛血清DMEM培养液加10 μg/L VEGF，37 ℃、5 %CO2 培养箱中静置培养，每2天换液1次。
1．3 增殖分析 采用MTT法。0．25%胰酶消化体外增殖的EPCs并计数，再将200 μl 1×10�7个/L EPCs 均匀接种到包被有明胶的96 孔培养板， 共分4组：对照组，1 μg/L SDF-1α组，10 μg/L SDF-1α组，100 μg/L SDF-1α组(n＝5)。培养48 h后每孔加10 μlMTT(5 mg/ml)，37 ℃、5 %CO2 培养箱继续培养4 h 后，吸弃上清液，再加入二甲基亚砜(150 μl/孔)，于微量振荡器充分振荡10 min，置酶标仪于波长490 nm 处测OD 值。
1．4 次级内皮祖细胞集落单位形成：0．25%胰蛋白酶从杂交瘤皿小孔消化初级内皮祖细胞集落单位细胞，取2 ml 5 ×106个/L EPCs接种在明胶包被的6孔板。加不同终浓度的SDF-1α(0 ，1，10，100 μg/L SDF-1α(n＝5))共孵育。 计数1周内次级内皮祖细胞集落单位数和集落单位细胞数目。
1．5 统计学处理 数据以均数±标准差(x±s)表示，采用spss11．5统计学软件。两组间采用t检验，P 2．3 SDF-1α对次级内皮祖细胞集落单位数目和大小的影响 将内皮祖细胞集落单位细胞消化下来，重新接种后可形成次级内皮祖细胞集落单位，SDF-1α处理组集落单位的数目增加，而且集落大小也明显增加。对照组与100 ng/mlSDF-1α处理组次级内皮祖细胞集落单位数目(个)分别为 4．67±0．577、14．33±3．055。同时随着培养时间的延长，再次形成的集落单位不断长大，SDF-1α处理组较对照组集落单位直径大、细胞密度高(图2)。
对照组和100 ng/ml SDF-1α处理组内皮祖细胞重新接种后1、3、6 d次级内皮祖细胞集落单位生长情况。加SDF-1α组集落单位细胞较对照组集落单位直径大、密度高。
3 讨论�
1997年，Asahara等人[13]首次报道了成人血中可以分离纯化得到CD34�+造血干细胞，在体外可分化为内皮表型细胞，表达内皮细胞标志物并且参与血管形成，他们将此种细胞命名为内皮祖细胞。大量的研究表明内皮祖细胞在缺血后血管新生、损伤血管的再内皮化中起重要作用。�
Fujiyama[14]发现，在没有其它药物和细胞因子的情况下，EPCs单独注射后，很快聚集于血管损伤部位，但3 d后就基本消失，而在单核细胞趋化蛋白-1的作用下，可以在血管损伤部位存活，并分化为内皮细胞，完成血管修复。但由于多种因素都将可能损害EPCs，特别是一些动脉粥样硬化危险因子，如、高血糖、高血压、吸烟、同型半胱氨酸、血脂异常、活性氧等。因此，寻找促进改善EPCs生物学活性的因子，特别是内源性因子，有望成为EPCs治疗心血管疾病的突破口。�
SDF-1α是新近发现的趋化因子，主要在骨髓基质细胞表达，另在骨髓血管内皮细胞和平滑肌细胞及CD34�+、CD38�+造血祖细胞中亦有表达。体外实验表明，SDF-1还在人的T淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞有表达，而且在胰腺、脾脏、卵巢、小肠等器官中有高水平表达，脑组织、大肠、胎盘中有低水平表达[15-16]。Voermans用罗丹明染色和FACS技术形象的证实了SDF-1α诱导CD34�+前体细胞内肌动蛋白的聚集，刺激局部黏附蛋白的酪氨酸磷酸化而改变细胞骨架结构，诱导造血干/祖细胞的迁移[17]；研究表明，SDF-1α与c-kit�+细胞联合注射可促进EPCs形成毛细管样结构[18]， 而CXCR4的拮抗剂AMD3100体外显著抑制SDF-1诱导的内皮细胞形成血管样的结构，并且在大鼠动脉血管功能不全模型上SDF-1增加供血的能力与VEGF一样强[19]；SDF-1单独和与VEGF联合，可显著提高内皮细胞存活时间[18]，抑制凋亡的发生，并促进细胞进入G1期[20]； 提示SDF-1α可能对内皮祖细胞的活性和生物学功能具有调节作用。�
基于此，本实验旨在通过研究SDF-1是否影响内皮祖细胞的增殖和克隆形成来探讨是否改善体外培养内皮祖细胞的生物学活性。我们的研究结果证明SDF-1α呈浓度梯度改善内皮祖细胞的生物学活性，提高内皮祖细胞的增殖能力、克隆形成率。已有研究表明内皮祖细胞本身可表达结构型CXCR4蛋白，因此我们推测当加入外源SDF-1α后，上调诱导型CXCR4表达。CXCR4本身作为G蛋白耦联螺旋型受体超家族成员，将激活磷脂酰肌醇(-3)激酶PI3K并加强膜脂质特异性产物产生[21]。这些脂质反过来又依赖磷酸肌醇依赖激酶-1(PDK-1-dependent)刺激大量下游信号事件，包括PKB/AKt和大量PKC同工酶调节，从而促进内皮祖细胞的增殖和克隆形成，改善内皮祖细胞的生物学活性。�
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