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【摘要】 目的 建立测定人血浆中奥美拉唑的HPLC-UV法, 测定健康志愿者口服奥美拉唑肠溶胶囊20 mg后的药代动力学参数,并评价其与参比制剂的生物等效性。方法 以乙醚提取血浆样品中的奥美拉唑,进行HPLC分析,20名健康志愿者交叉口服奥美拉唑肠溶胶囊试验和参比制剂20 mg,用HPLC法测定血药浓度,计算主要药代动力学参数及相对生物利用度,以判断其生物等效性。结果 在3.924～1962 ng/ml范围内奥美拉唑与内标的峰面积比值与浓度呈良好的线性关系,以AUC0-12计算的供试制剂相对生物利用度为(99.4±13.8) %,受试奥美拉唑肠溶胶囊的相对生物利用度(99.4±13.8)%。结论 本文所建立的HPLC分析方法灵敏、准确、简便,临床实验的药动学统计数据表明两种奥美拉唑胶囊生物等效。
【关键词】 奥美拉唑;药代动力学;高效液相色谱法
本实验通过测定血浆中奥美拉唑的浓度观察中国健康志愿者口服浙江双伟制药有限公司仿制的奥美拉唑肠溶胶囊(受试制剂)后的血药浓度经时过程,估算其相应的药代动力学参数,并以阿斯利康制药有限公司生产的奥美拉唑肠溶胶囊(洛赛克)为参比制剂,估算受试制剂的相对生物利用度,为临床用药提供参考。
1 实验材料
1.1 仪器 Agilent 1100液相色谱仪,含:双高压泵,自动进样器(带温控系统),柱温箱,紫外检测器。色谱工作站:Agilent Chemstation(A.10.02)。TGL-16B高速离心机(上海安亭科学仪器厂);旋涡振荡混和器(上海医科大学仪器厂)。
1.2 药品和试剂 奥美拉唑对照品由浙江省药品检定所标化,含量99.7%;尼美舒利对照品由浙江双伟制药有限公司提供,含量99.6%。奥美拉唑肠溶胶囊(浙江双伟制药有限公司,批号040320,20 mg/粒, 受试制剂)。奥美拉唑肠溶胶囊(洛塞克)(阿斯利康制药有限公司,批号0411005,20 mg / 粒,参比制剂)。甲醇(色谱纯,德国Merck公司);乙酸铵、冰乙酸、三乙胺为分析纯;水为去离子纯净水。
2 实验方法
2.1 色谱条件 色谱柱:Lichrospher ODS (25 cm × 4.6 mm,淮阴汉邦科技有限公司);流动相:水(1%的冰醋酸+1%三乙胺)-甲醇 (37�∶�63,V/V),流速:1.0 ml/min,柱温:30℃,进样器控制温度:5℃,检测波长:302nm;进样量:10 l。
2.2 血浆样品的处理 于10 ml离心管中精密加入内标溶液(10.52 μg/ml尼美舒利甲醇溶液)50 μl,以氮气流吹干, 精密加入血浆样品1 ml,旋涡3 秒混匀,加入6 ml乙醚,涡旋4 min,于4000 r/min离心10 min,吸取有机相转移至另一10 ml玻璃离心管中,于室温中氮气流吹干,加入流动相100μl溶解残渣,于16000 r/min离心2 min,吸取上清液转移至自动进样器样品管中,进行HPLC分析。
2.3 数据分析 将所得血药浓度-时间数据经自然对数转换后,用最小二乘法对尾段相回归计算消除速率常数k,C�max�及T�max�均为实测值;消除半衰期(t�1/2�)、曲线下面积(AUC)分别按下列各式估算:t�1/2�=0.693/k,AUC�0-96�=∑Ci + C�i-1�)•( ti -t｝)/2,AUC�0-∞�= AUC�0-96�+ C�96�/ k,其中C96为最后取样点浓度,k为末端消除速率常数。
所得参数(T�max�、C�max�、AUC�0-12�、AUC�0-∞�)用交叉试验设计的方差分析,其中C�max�、AUC�0-12�、AUC�0-∞�经自然对数转换后先进行方差分析,然后进行双单侧t检验(显著性水平α= 0.05)。
3 实验结果
3.1 色谱行为及方法的专属性 在本实验所采用的HPLC-UV条件下,奥美拉唑出峰时间在6.6 min左右,内标出峰时间在9.5 min左右。奥美拉唑和内标峰形良好,无杂峰干扰测定。本方法具有较高的特异性,能准确测定血浆中的奥美拉唑的浓度。
3.2 血浆中奥美拉唑标准曲线制备及灵敏度
取10 ml玻璃离心管数支,分别精密加入不同量的奥美拉唑标准液,加入空白血浆1 ml,涡旋混匀,配成含奥美拉唑分别为3.924、9.810、29.43、98.10、196.2、490.5、981.0、1962 ng/ml的标准血浆,按“2.2”项下操作,计算奥美拉唑峰面积As和内标峰面积Ai的比值f(f=As/Ai),以f值对血药浓度(C)作权重回归计算,得回归方程。不同5 d,每天做一条标准曲线,以f值的平均值对血药浓度(C)作回归计算,得回归方程:f= 0.0021756×C + 0.0002889(权重系数w = 1/C,r=0.9998),按上述条件测得奥美拉唑在血浆中的最低定量限为3.924 ng/ml (S / N ≈10 )。
3.3 回收率试验(绝对回收率) 取10 ml玻璃离心管数支,分别取奥美拉唑标准液适量于离心管中,用甲醇配成浓度分别为9.810、98.10、490.5、1962 ng/ml的奥美拉唑甲醇溶液,每份1 ml,每种浓度配制2份。加入内标溶液50 μl,涡旋混匀,氮气流吹干,加入流动相100μl溶解残渣,于16000 r/min离心2 min,吸取上清液转移至自动进样器样品管中,进行HPLC分析,计算样品和内标的峰面积比值fs (fs=As/Ai)。
取10 ml玻璃离心管数支,分别精密加入不同量的奥美拉唑溶液适量,精密加入1 ml空白血浆,涡旋混匀,配成含奥美拉唑9.810、98.10、490.5、1962 ng/ml的血浆,每种浓度各做5份样品。加入乙醚6 ml,涡旋4 min,于4000r/min离心10 min,精密吸取有机相4.5 ml置10 ml玻璃离心管中,加入内标溶液50 μl,涡旋混匀,室温中以氮气流吹干,加入流动相100 μl溶解残渣,于16000r/min离心2 min,吸取上清液转移至自动进样器样品管中,进行HPLC分析,计算样品和内标的峰面积比值fx (fx=As/Ai),将上述fx和fs的比值代入公式R% = (fx×6) / (fs×4.5)即可求得奥美拉唑的绝对回收率(R%)。高中低4个浓度9.810、98.10、490.5、1962 ng/ml奥美拉唑血浆的绝对回收率分别为82.3%、84.1%、87.8%、90.7%。
3.4 准确度试验(相对回收率) 取10 ml玻璃离心管数支,按标准曲线配制方法制备含奥美拉唑浓度分别为9.810、98.10、490.5、1962 ng/ml的含药血浆,每个浓度做5份,按“血浆样品的处理”项下操作,计算奥美拉唑峰面积As和峰面积Ai的比值,将该比值代入当天随行标准曲线方程,计算所得浓度与加入浓度的比值即为相对回收率,高中低4个浓度9.810、98.10、490.5、1962 ng/ml奥美拉唑血浆的准确度分别为91.0%、94.4%、95.6%、99.1%。
3.5 精密度试验 取10 ml玻璃离心管数支,按标准曲线配制方法制备含奥美拉唑浓度分别为9.810、98.10、490.5、1962 ng/ml的含药血浆(每个浓度做5份样品)及一条随行标准曲线,按“2.2”项下操作。每天配制一批及一条随行标准曲线,连续做3 d,共三批,每批每个浓度做5份样品,计算奥美拉唑峰面积As和内标峰面积Ai的比值f,代入当天的标准曲线求得实测浓度,计算批内和批间精密度。9.810、98.10、490.5、1962 ng/ml的含药血浆的批内和批间精密度分别为11.3%和11.9%,4.4%和10.0%,2.9%和8.2%,1.2%和2.1%。
3.6 稳定性试验 取10 ml玻璃离心管数支,按标准曲线配制方法制备含奥美拉唑浓度分别为9.81、98.1、490.5、1962 ng/ml的含药血浆,每种浓度各配制 15 ml,然后精密吸取10份,每份1 ml。2份于配制好后按“2.2”项立即分析;2份配制好后反复冻融两次后分析;2份于室温放置8 h后分析;2份配制好后放入-20℃冰箱中冷冻保存6 d后取出化冻后分析;在试验期间上述储藏条件经反复冻融不影响血浆中奥美拉唑的含量测定。2份按血样处理方法项下处理,处理后的样品在放置0、1、6、12 h后进样分析,进样样品在5℃自动进样器中稳定性良好。
3.7 方法质量控制(随行标准曲线及质控样品) 受试者血浆样品的测定在分析方法确证完成之后进行。在每批血浆样品测定的同时建立相应的标准曲线(即随行标准曲线)及质控样品,随行标准曲线的配制方法见“3.2”项下,质控样品为含奥美拉唑浓度分别为9.81、98.1、490.5、1962 ng/ml的标准含药血浆,每批血浆样品的浓度数据用随行标准曲线求得,根据高、中、低4个浓度质控样品的准确度测定结果分别为96.7%、100.6%、100.1%、99.7%,即评判该批样品的测定数据可被接受。
3.8 药动学研究 20名受试者分别口服参比和供试两种制剂20 mg后的奥美拉唑平均血药浓度-时间曲线见图1。
图1 受试者分别口服两种制剂20 mg后的奥美拉唑平均血药浓度-时间曲线
采用中国药科大学药代中心杨劲教授编写的BAPP2.0软件计算主要药动学参数,奥美拉唑肠溶胶囊受试制剂和参比制剂的t�1/2�分别为(2.22±0.77)h和(1.96±0.48)h,达峰浓度分别为(481.6±306.7)ng/ml和(492.7±325.2)ng/ml,达峰时间分别为(2.6±1.0)h和(2.8±0.9)h。以AUC0-12计算的受试奥美拉唑肠溶胶囊的相对生物利用度(99.4±13.8)%,临床实验的药动学统计数据表明两种奥美拉唑胶囊生物等效。
对两种制剂口服后的奥美拉唑参数Cmax、AUC0-τ和AUC0-∞经自然对数转换后,先进行方差分析,再进行双单侧t 检验,结果表明,两种制剂的上述参数生物等效,其T�max�经非参数法检验无显著性差异(P>0.05),表明这两种制剂生物等效。
4 讨论
4.1 奥美拉唑稳定性 奥美拉唑结构中含有亚砜基使其稳定性降低,对光、湿、酸等条件敏感,其在碱性条件下是稳定的,在酸性条件下不稳定。笔者在血浆样品的前处理及测定过程中都注意避光,具体做法为将自动进样器用黑纸遮蔽并将温度设定在5℃。对于抽取的受试者血浆样本及时提取,在7 d内测定完毕。
4.2 奥美拉唑肠溶胶囊人体药代动力学特点 奥美拉唑肠溶胶囊由一个个非常小的肠衣微颗粒组成,在小肠内才被崩解吸收,本实验第0.5 h取样点平均血浓仅为10ng/ml是C�max�的1/30,甚至有5名受试者血浓低于检测限,血药浓度吸收曲线体现了受试、参比肠溶制剂在人体消化道中正确的吸收过程。
奥美拉唑肠溶胶囊(洛赛克)说明书指出奥美拉唑存在肠肝循环,本次实验中60%受试者服药后其血药浓度曲线存在“双峰”现象是奥美拉唑存在肠肝循环的体现。
参 考 文 献
[1] 丁黎,杨劲,闫花丽,等.人血浆中奥美拉唑高效液相色谱测定法及其药代动力学研究.药物分析杂志,1999,19(5):300-303.
[2] 付良青,黄丰,吴政德,等.中国健康志愿者的奥美拉唑及代谢产物的药代动力学. 中国药理学与毒理学杂志,2003,17(1):51-54.
