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【摘要】 通过紫外和自由基聚合在PLLA上接枝聚丙烯酸(PAA),制备了平均粒径316 nm,zeta电位-39.88 mV的表面亲水性PLLA纳米粒子,与胶原溶液混合通过冷冻干燥法制备了胶原/PLLA纳米粒子复合多孔支架。复合支架材料的孔隙率与纯胶原支架相近,而密度、湿态压缩模量有明显提高,降解率降低显著。随着复合支架中PLLA纳米粒子的增加,L929细胞在材料中的播种效率和增殖有明显提高,表明胶原/PLLA纳米粒子复合多孔支架是一种理想的组织工程支架材料。
【关键词】 胶原;PLLA纳米粒子;支架材料;生物相容性
Hybrid porous scaffold derived from collagen and PLLA nanoparticles
LU Wei,FENG Yu-jie,YAN Xiao-li,et al.National Engineering Research Center for Biomaterials,Sichuan University Chengdu 610064,China
【Abstract】 Poly (acrylic acid) was grafted on PLLA through UV radiation,and PLLA nano-particles were prepared. Then collagen/PLLA nano-particle hybrid sponge was fabricated. The porosity of hybrid sponge was similar with that of collagen sponge,whereas density and wet modulus were improved,and the degradation was largely inhibited. The cell seeding efficiency and proliferation on the hybrid sponge was obviously promoted,indicating that the hybrid sponge was promising in tissue scaffold.
【Key words】Collagen; PLLA nano-particle; Scaffold; Biocompatibility
基金项目:国家863计划重大项目资助研究课题(项目编号:2006AA02A125)
作者单位:610064成都,四川大学国家生物医学材料工程技术研究中心
支架材料是组织工程的重要因素之一,不仅提供细胞生长的空间结构和几何形状,而且影响细胞的黏附、增殖和分化,是组织工程中不可或缺的一环[1-3]。胶原是一类蛋白质材料,不仅可为细胞提供支持保护作用,而且与细胞的粘附、增殖、分化、表型表达均有密切关系,是组织工程中常用的支架材料[4]。但由于胶原本身力学强度较低而常常无法维持需要的形态和结构。将生物降解合成高分子材料(PLLA、PLGA等)与胶原共混制备复合材料是提高其力学性能的常用方法[5],但疏水性的PLA、PGA和PLGA等与亲水性的胶原间缺乏亲和力。本文制备了表面亲水PLLA纳米粒子/胶原复合支架,提高了力学强度,降低降解率,细胞生物学检测表明其具有良好的细胞相容性。
1 实验部分
1.1 PLLA纳米粒子的制备及表征 将PLLA粉料分散于双氧水中,紫外光照4 h,水洗、干燥,然后用水分散,与丙烯酸和硫酸亚铁铵在氮气保护下反应30 min,经纯水和乙醇反复洗涤后干燥。产物用四氢呋喃溶解,去离子水透析,冻干后得到表面改性后PLLA纳米粒子。用SEM和DLSP表征其形貌,粒径和zeta电位。
1.2 胶原/PLLA纳米粒子复合支架材料的制备 在胶原醋酸溶液中加入不同量的PLLA纳米粒子,使其均匀分散,在20℃冻干,经100 pa,105℃真空干热交联48 h,50 mmol的EDC和NHS溶液交联48 h。用SEM观察其形貌。
1.3 孔隙率和密度 将称重后(W�0)的海绵支架浸泡在乙醇中,减压处理20 min后,将海绵取出称质量We。
孔隙率:P= (We-W�0)/(V�s)×100%。
密度:D=W�0/V�s。
式中, 为室温下乙醇密度(0.789 mg/ml),Vs由海绵高度和横截面计算。
1.4 湿态压缩模量 将支架材料浸泡在PBS中,经真空处理使PBS溶液完全渗透。然后用万能力学试验机测量压缩模量。
1.5 降解率 将支架材料称重(W�0),分别装入培养板,加入PBS溶液于37℃静置。定期取样冻干称重(W�d)。降解率 = (W�0-W�d)/W�0×100%。
1.6 体外细胞播种及检测 支架灭菌清洗后,用培养基浸泡至溶胀平衡。将L929细胞(1×107/ml)滴加到支架上(100 L/片),培养4 h使细胞黏附,然后加入1.5 ml新鲜培养基进行培养。在不同时间取样,用CLSM、SEM观察细胞在支架材料上的生长情况。用木瓜蛋白酶消化试样,用H33258染色,测460 nm的吸收值检测DNA量。
2 结果与讨论
2.1 PLLA纳米粒子的制备及表征 在双氧水中紫外福照作用下,PLLA表面形成过氧基团,与二价铁离子氧化还原体系引发丙烯酸在PLLA表面自由基接枝共聚,形成PLLA-g-PAA接枝共聚物。由于丙烯酸链的引入,PLLA表面形成亲水链段。将接枝共聚物溶于四氢呋喃,在水中透析,可形成能在水中稳定存在的纳米粒子。SEM和DLS测试表明,纳米粒子为均匀的球形,平均粒径为316 nm,zeta电位为-39.88 mV,说明其表面由带负电荷的聚丙烯酸所覆盖。
2.2 胶原/PLLA纳米粒子复合支架材料的制备与表征 表面改性的PLLA纳米粒子可与胶原溶液均匀混合,无团聚现象及沉淀的产生。经冷冻干燥和交联处理,得到多孔胶原/PLLA纳米粒子复合支架材料。SEM观察表明,其平均孔径约为200 μm,PLLA纳米粒子含量增加,其平均孔径基本无变化。但孔壁厚度和表面粗糙程度增加。对于组织工程支架材料,200 μm的孔径适合细胞的播种,营养物质和代谢废物的交换,以及新生组织的形成。孔壁厚度的增加使得支架力学强度提高,而表面粗糙度的增加使细胞贴壁和粘附生长更为容易。
图1为不同PLLA纳米粒子含量的多孔支架材料的空隙率和密度。由图可见,随着PLLA纳米粒子含量的提高,复合海绵的孔隙率基本无变化,但密度性增加。由于组织工程支架孔隙率的大小直接决定着支架营养物质交换的大小程度,足够大的支架孔隙率将使得更多的细胞粘附生长。
图1 不同纳米粒子含量的复合支架材料的孔隙率(A)和密度(B)
图2为不同PLLA纳米粒子含量的多孔支架材料的湿态压缩模量。由图可见,同纯胶原多孔支架相比,PLLA纳米粒子的加入大大提高了海绵的湿态模量。随着PLLA纳米粒子量的增加,粒子的物理增强作用,以及其表面上丙烯酸的羧基与胶原氨基反应形成的化学键增强,使得海绵压缩模量从0.78 kpa (Col:NP=6:0) 增加到 1.3,2.5,和3.5 kpa(Col:NP=6:1,6:3和 6:6,)。其强度大小可以通过调节PLLA纳米粒子含量调节。
图2 不同纳米粒子含量的复合支架材料的湿态压缩模量
由于PLLA纳米粒子表面的羧基与胶原分子氨基反应后,增加了支架材料德交联程度,多孔支架材料的降解率随着PLLA纳米粒子含量的增加而降低。纯胶原多孔支架在14 d后降解达70%以上,而Col:NP=6:6的复合支架材料在14 d后的降解率仍然低于10%,这为细胞生长增殖提供了更持久稳定的空间环境。
3.3 体外细胞播种及培养 胶原/PLLA纳米粒子复合支架材料由于PLLA纳米粒子的添加,改善了其机械性能,使支架的稳定得以提高,从而有利于细胞的播种和增殖。图3为细胞播种由24h后的CLSM结果。由图中可见,随PLLA纳米粒子含量的增加,支架上细胞数量明显增加,可见细胞成片粘附在海绵孔壁上。这说明支架材料力学性能的提高有利于细胞迁移到支架材料内部,并增加细胞的粘附。支架材料稳定性的增加使营养物质的交换和生理代谢废物的排出更为容易,对细胞的增殖体现出促进作用。对培养1,3,5 d后不同支架材料中细胞的DNA量进行定量测定,结果表明,随支架中PLLA纳米粒子含量的增加,DNA量从纯胶原支架中的0.5 μg增加到Col:NP=6:6的复合支架材料中的2.5 μg,表明在复合支架材料中细胞的数量有非常明显的提高。
图3 不同纳米粒子含量的复合支架材料播种L929细胞后的CLSM图像。从左至右:Col:NP=6:0; 6:1; 6:3; 6:6
4 结论
通过自由基接枝聚合,在PLLA表面引入聚丙烯酸,制备了表面包裹可反应性羧基的PLLA纳米粒子,并与胶原溶液混合,通过冷冻干燥制备了胶原/PLLA纳米粒子复合支架材料,其孔隙率和孔径与纯胶原支架材料相近,而密度、湿态压缩模量均有明显提高,降解率降低显著。这种复合支架材料对细胞的粘附的增殖有良好的促进作用,可望成为一种有用的组织工程支架材料。
参 考 文 献
[1] 曹峻岭,付强.组织工程化软骨的构建及应用.西安交通大学学报(医学版),2008,29(2):121-126.
[2] Cindy Chung,Jason A.Burdick.Engineering cartilage tissue.Adv Drug Delivery Rev,2008,60:243-262.
[3] 鄂征,刘流.医学组织工程技术与临床应用.北京出版社,2003.
[4] T.Bhardwaj,R.M.Pilliar,M.D.Grynpas,R.A.Kandel.Effect of material geometry on cartilagenous tissue formation in vitro.J Biomed Mater Res,2001,57:190-199.
[5] G.Chen,T.Ushida,T.Tatsuya,Hybrid Biomaterials for Tissue Engineering:A Preparative Method of PLA or PLGA-Collagen Hybrid Sponge.Adv Mater,2000,12:455.
