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摘 要：目的：测定不同来源滇白珠根中木脂素苷含量，进一步探讨滇白珠质量标准的制定。方法：HPLC-DAD联用检测技术。色谱柱：Kromasil C18，流动相为甲醇-乙腈-0.1%TFA(25∶5∶70)；检测波长220nm，流速0.7 ml/min，柱温为25℃，外标法定量。结果：进样量与峰面积线性关系良好(D2、D3均为 r=0.9999)。D2平均回收率为100.8%，RSD 2.4%。比较不同产地药材木脂素苷D2、D3含量，遵义样品D2含量最高，而广西几乎不含D2，但D3含量最高。不同月份药材木脂素苷D2、D3含量呈一定趋势变化，其中10月和3月的木脂素苷D2、D3含量较其他月份高。结论：此方法简便、可靠，可以作为评价滇白珠质量的参考方法。
关键词：滇白珠；HPLC-DAD；木脂素苷；含量测定
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1673-2197(2008)04-041-03
滇白珠〔Gaultheria leucocarpa Bl.var.crenulata(Kurz) T.Z.Hsu〕为杜鹃花科植物滇白珠的全株或根，广泛分布于我国西南地区和华南地区；《中药大辞典》和《中国民族药志》均有记载。它具有祛风除湿、活血化瘀、通络止痛、清热解毒等功效，用于治疗风湿性关节炎、关节肿痛、跌打损伤、慢性气管炎和风寒感冒等症[1，2]。一般认为水杨酸甲酯是可能的有效成分，但马小军等人通过建立和改进分析木脂素苷的高效液相法[3，4]，研究了滇白珠不同来源[4]、不同季节、不同地区[5]、不同白珠树属[6]的木脂素苷含量，建议暂用滇白珠木脂素苷含量作滇白珠的质量标准。近年来HPLC-DAD联用检测技术因其具有高灵敏度和高选择性，已被广泛运用于多组分定性、定量和纯度检测。本文记载了利用此技术测定的7个不同地区，11个不同月份滇白珠根的木脂素苷含量，进一步探讨了滇白珠质量标准的制定。
1 仪器与试药
Agilent 1100 series高效液相色谱仪(真空脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD二级管阵列检测器、HP 1100 3D化学工作站，美国安捷伦科技有限公司)；AG258电子天平(METTLE TOLEDO)；KQ-250型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；四孔电子恒温水浴锅(上海金桥科析仪厂)。木脂素苷(+)-lyoniresinol-2α-O-α-L-arabinopyranoside(D1)，(-)-5-甲氧基异落叶松树脂醇-2α-O-β-D-吡喃木糖苷(D2)，(-)-异落叶松树脂-2α-O-β-D-吡喃木糖苷(D3)均为自制，纯度>99%。
甲醇(色谱纯，Merck公司)、乙腈(色谱纯，Dima公司)、三氟乙酸(TFA，分析纯，Schartau chemie.S.A公司)、水为乐百氏纯净水，用时经0.45μm微孔滤膜过滤。
不同地区和不同时间的滇白珠药材均为当地采集或当地药材市场购买，由贵阳中医学院孙庆文老师鉴定，其中广西样品为Gaultheria leucocarpa Bl.var.cumingiana(Vidal.)T.Z.Hsu 的根，其余16个样品均为Gaultheria leucocarpa Bl.var.crenulata(Kurz) T.Z.Hsu的根。17个样品标本存于中国科学院天然产物化学重点实验室(位于贵州省)。
2 方法
(1)色谱条件。色谱柱：Kromasil C18(0.46cm×25cm，5μm)，流动相为甲醇-乙腈-0.1% TFA(25∶5∶70)；检测波长220nm，流速0.7ml/min，柱温为25℃，外标法定量。
(2)对照品溶液的制备。精密称取对照品D1 5.01mg，D2 4.97mg，D3 5.03mg放于5ml的量瓶中，加3ml甲醇加热溶解，待冷却，用甲醇定容至刻度。取混合对照品1ml定容于10ml容量瓶中，得约0.1mg/ml混合对照品液。
(3)供试品溶液的制备。精密称取粉碎后经过40目筛的干燥样品0.5g，加入30%甲醇25ml，称重，90℃水浴回流2h，冷却至室温，补足减轻的重量，离心，取上清液过0.45μm微孔滤膜，得供试品溶液。按上述色谱条件吸取样品20μl进样，按峰面积计算含量。
(4)标准曲线绘制。吸取约0.1mg/ml浓度的D2，D3和D1混合对照液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，8.0和10.0μl，按上述色谱条件测峰面积。以混合标准液进样量(μg)为横座标(X)，峰面积为纵座标(Y)，峰面积对浓度进行回归计算。D2，D3，D1的回归方程分别为Y2=5326.6X-24.497，Y3=5414.9X-56.376，Y1=3351.3X+50.364；r值分别为0.9999，0.9999，0.9999；线形范围分别为0.0994~0.994μg，0.1006~0.6036μg，0.1002~0.6012μg。
(5)精密度试验。取约0.1mg/ml混合对照品溶液，连续进样6次；D2，D3和D1峰面积的RSD值分别为1.79%，1.08%，1.65%，结果表明方法精密度良好。
(6)重现性试验。取贵阳2007年3月样品，按2.3项方法，分别制备6份供试品溶液，测定木脂素苷成分D2，D3的峰面积，其RSD值分别为0.83%，4.3%，结果表明方法重现性良好。
(7)稳定性试验。精密吸取重现性试验中第二份样品溶液，于0h，1h，2h，4h，8h，12h测定木脂素苷成分D2，D3的峰面积，其RSD值分别为1.03%，3.69%，结果表明样品在12h内稳定。
(8)加样回收率。取贵阳2007年3月样品6份，每份约0.5g，精密称定，分别精密加入浓度为0.5486mg/ml的D2对照品溶液1ml，按“2.3”项下方法，制备供试品溶液，测定D2的含量，并计算加样回收率(表1)。
3 样品分析
(1)三个木脂素苷波长的选择。通过DAD检测器全扫描，并同时观察其UV图谱(如图1)。
D2对照品
D3对照品
D1对照品
图1 对照品UV图谱
可以得出三个木脂素苷的最大吸收峰在206nm左右并且275nm处有一宽峰，因206nm靠近末端吸收，而275nm处是一宽峰且峰面积较小，故选定峰面积较大且受末端吸收影响较小的220nm作为测定波长。
(2)样品分析。取贵阳(2007年3月)、遵义、兴义、都匀、安顺、云南、广西7个地区和贵阳地区11个月份样品，按“2.3供试品溶液的制备”制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，按“2.1色谱条件”测定样品，按峰面积计算木脂素苷D2、D3含量。从图2中可看出，D1在样品中含量很低。
对照品
贵阳样品(2007年3月)
图2 对照品和样品HPLC色谱图
(3)11个不同月份木脂素苷D2、D3含量比较。由图3显示，2006年10月和2007年3月的木脂素苷D2、D3含量高于其他月份，这与植物的生长周期相符。
图3 不同月份木脂素苷D2、D3含量
注：1～5表示贵阳样品采集的时间依次为2006年8～12月，6～9表示时间为2007年1～4月，13～14表示时间为2007年8月、9月。
(4)7个不同地区木脂素苷D2、D3含量比较(图4)。图4显示：遵义样品D2含量最高，而广西几乎不含D2，但D3含量最高。
图4 不同地区木脂素苷D2、D3含量
4 讨论
(1)提取条件的选择。文献曾报道用30%甲醇作为提取溶剂，本试验比较了甲醇，75%乙醇，30%甲醇三种溶剂，证实30%甲醇较前两者提取效率高。本试验还比较了超声30min与水浴回流2h两种提取方法，得出水浴回流优于超声提取。
(2)分离条件的选择。本试验选择了Kromasil C18(0.46cm×25cm，5μm，E25864)，Hypersil C18(0.4cm×25cm，5μm，2104268)，Aglient Hypersil ODS(0.46cm×25cm，5μm，lot 4814)三种色谱柱，及0.4%醋酸、0.1%磷酸、0.1%TFA三种酸以及各种比例作流动相进行等度洗脱和梯度洗脱试验，结果表明Kromasil C18(0.46cm×25cm，5μm)，流动相为甲醇-乙腈-0.1% TFA(25：5：70)；检测波长220nm，流速0.7ml/min，柱温为25℃，能使D1、D2、D3完全达到基线分离。
(3)文献曾报道D1、D2、D4易获得并测定了上述三种对照品含量，但作者从贵阳2006年8月滇白珠根茎中仅分离得到D1、D2、D3，并且发现17个样品中D1含量都极少，难于定量，故在重现性试验及稳定性试验中未涉及。
(4)本试验比较了贵阳2007年3月样品的根，茎、叶三部分木脂素苷D2、D3含量，发现根与茎的含量相当，但叶含量几乎没有。
参考文献：
[1] 江苏新医学院.中药大辞典(下)[M].上海：上海人民卫生出版社，1977：1879.
[2] 卫生部药品生物制品检定所.中国民族药志[M].北京：人民卫生出版社，1992：556.
[3] 张治针，果德安，李长龄，等.高效液相色谱法测定滇白珠木脂素苷的含量[J].中国中药，1999，24(3)：164.
[4] 赵玉娟，韩振泰，王文芝，等.高效液相色谱法测定滇白珠植物中滇白珠甙[J].分析化学，2002，9(30)：1109.
[5] 马小军，赵铃，赵玉娟，等.不同来源滇白珠木脂素苷含量的研究[J].中国中药，2002，27(1)：25.
[6] 马小军，赵铃，赵玉娟，等.不同地区和季节对滇白珠中木脂素苷含量的影响[J].中草药，2002，33(4)：353.
[7] 马小军，赵玲，韩振泰，等.白珠树属5种药用植物木脂素苷含量的比较[J].植物资源与环境学报，2002，11(2)：61.
(责任编辑：王尚勇)
Determination of Lignan Glycosides in
Gaultheria leucocarpa by HPLC-DAD
Xie Hong�1，2，Yang Juan�2，WANG Dao-ping�2
(1.The Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550001.Guizhou，China；
2.The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and
Chinese Academy of Sciences，Guiyang 550002，Guizhou，China)
Abstract：Objective：The contents of lignans in Gaultheria leucocarpa from seven regions and eleven months were detected to control the quality of Gaultheria leucocarpa.Method：HPLC-DAD was adopted using Kromasil C18 column，methanol：acetonitrile：0.1%TFA-water(25：5：70) as mobile phase，the flow rate was 0.7 ml/ min，the detection wavelength and column temperature were 220nm and 25℃，respectively.Results：There was a good liner relationship between injected volume and peak area.The average recovery of D2 was 100.8%，and RSD was 2.4%.Comparing the content of lignans in Gaultheria leucocarpa from seven regions，Zunyi showed the highest content of D2(74.2 mg/100 g)，and that of Guangxi was little.But the content of D3 in Guangxi sample was highest.To observe the tendency of the content of D2，D3 in Gaultheria leucocarpat from eleven months，it was higher than other months in October and March.Conclusion：The method has been proved to be accurate，reproducible and of higher recovery rate.
Key words：Gaultheria leucocarpa；HPLC-DAD；contents of the lignan glycosides
