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摘 要：目的：对痛经灵颗粒进行质量标准研究。方法：采用薄层色谱法对痛经灵颗粒进行定性鉴别；采用高效液相色谱法对痛经灵颗粒中的丹酚酸B进行含量测定。结果：丹酚酸B的线性范围分别为0.264～1.584g，平均回收率为100.65%。结论：方法可行、重复性好，能有效地控制痛经灵颗粒的质量。
关键词：痛经灵颗粒；质量标准
中图分类号：R286.0 文献标识码：A 文章编号：1673-2197(2008)04-034-04
痛经灵颗粒为《中华人民共和国卫生部药品标准・中药成方制剂》第15册收载品种[1]。功能与主治为活血化瘀，理气止痛；用于气滞血瘀所致痛经。原质量标准中只收载了两个显色沉淀鉴别反应，无薄层鉴别项目，无含量测定项目，不利于药品质量控制。我们经过研究，增加了丹参、赤芍及元胡的薄层鉴别项目，并增加了高效液相色谱法测定处方中丹酚酸B的含量项目，以对原质量标准进行提高，进一步有效控制痛经灵颗粒产品质量。
1 仪器和材料
1.1 试验仪器
P200Ⅱ高效液相色谱仪：大连依利特科学仪器有限公司。
1.2 药品与试剂
对照品及对照药材购于中国药品生物制品检定所；所用试剂均为分析纯或色谱纯；痛经灵颗粒(自制)。
2 实验方法和结果
2.1 定性鉴别[2]
2.1.1 丹参的薄层色谱鉴别
取本品3g，加水40ml使溶解，置分液漏斗中，加(1→2)盐酸溶液5ml，用乙酸乙酯振摇提取4次，每次30ml，合并乙酸乙酯液，水浴蒸干，残渣加75%甲醇使溶解并定容至2ml，作为供试品溶液。另取丹酚酸B对照品，加75%甲醇制成每1ml含2mg的溶液，作为对照品溶液。按处方取不含丹参的其它药材照本品制备工艺和供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法(附录Ⅵ B)试验，吸取上述供试品溶液和阴性对照溶液各6μl，对照品溶液10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板(以等量4%磷酸氢二钠溶液与0.4%羧甲基纤维素钠溶液的混合溶液为粘合剂制备)上，以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(2∶3∶4∶0.5∶2)为展开剂，展开、取出、晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；阴性无干扰。用连续生产的20060101、20060102、20060103三批中试样品进行验证，结果均检出了丹酚酸B，如图1。此法简单、灵敏度高、重现性好、专属性强。
1，2，3为三批样品；4为丹酚酸B对照品；
5为缺丹参的阴性样品
图1 痛经灵颗粒中丹参的TLC(荧光)
2.1.2 赤芍的薄层色谱鉴别
取本品10g，研细，加70%乙醇100ml，超声处理 30win，滤过，滤液蒸干，残渣加水20ml使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次20ml，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次30ml，弃去水液，正丁醇液蒸至约1ml，加中性氧化铝2g，在水浴上拌匀，干燥，装入中性氧化铝小柱(100～200目，2g，内径10～15mm)上，用乙酸乙酯-甲醇(1∶1)混合溶液50ml洗脱，收集洗脱液，水浴蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，上清液作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加乙醇制成每 1ml含 2mg的溶液，作为对照品溶液。按处方取不含赤芍的其它药材照本品制备工艺和供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法(附录Ⅵ B)试验，吸取上述三种溶液各 10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2) 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 5%香草醛硫酸溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点；阴性无干扰。如图2。此法简单、灵敏度高、重现性好、专属性强。
1，2，3为三批样品；4为芍药苷对照品；5为缺赤芍的阴性样品
图2 痛经灵颗粒中赤芍的TLC1(日光)
2.1.3 元胡的薄层色谱鉴别
取本品10g，研细，加水20ml使溶解，加浓氨试液调至碱性，用乙醚提取3 次，每次30ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取延胡索对照药材1g，同法制成对照药材溶液。再取延胡索乙素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。按处方取不含元胡的其它药材照本品制备工艺和供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。照薄层色谱法(附录Ⅵ B)试验，吸取上述供试品溶液和阴性对照溶液10μl，对照药材溶液10μl，对照品溶液2μl，分别点于同一用1%氢氧化钠制备的硅胶G薄层板上，以正己烷-三氯甲烷-甲醇(7.5∶4∶1) 为展开剂，置以展开剂预饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，以碘蒸气熏至斑点显色清晰。日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；在空气中挥尽板上吸附的碘后，置紫外光灯(365nm) 下检视，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；阴性无干扰。如图3、图4。此法简单、灵敏度高、重现性好、专属性强。
1，2，3为三批样品；4为延胡索对照药材；5为延胡索乙素对照品；6为缺元胡的阴性样品。
图3 痛经灵颗粒中元胡的TLC1(日光)
1，2，3为三批样品；4为延胡索对照药材；5为延胡索乙素对照品，；6为缺元胡的阴性样品。
图4 痛经灵颗粒中元胡的TLC1(荧光)
2.2 丹酚酸B含量测定[2-3]
2.2.1 色谱条件与系统适用性试验
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-甲酸-水(30∶10∶1∶59)为流动相，检测波长：286nm。理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于3000。
2.2.2 对照品溶液的制备
精密称取丹酚酸B对照品适量，加75%甲醇制成每1ml含0.132mg的溶液，即得。
2.2.3 供试品溶液的制备
取本品3.0g左右，精密称定，加水50ml使溶解，置分液漏斗中，加(1→2)盐酸溶液2ml，用乙酸乙酯振摇提取5次(40、40、40、30、20ml)，合并乙酸乙酯液，水浴蒸干，残渣加适量75%甲醇使溶解，定容至50ml，即得。
2.2.4 乙酸乙酯提取次数的考察
分别取本品3.0g左右，精密称定，加水50ml使溶解，置分液漏斗中，加(1→2)盐酸溶液2ml，考察了振摇提取3次、4次、5次、6次的情况。其余操作过程按供试品溶液制备方法制备，分别按正文[含量测定]项下方法操作，进样量为10μl，测定峰面积值并比较结果，根据乙酸乙酯提取结果，提取5次峰面积，且提取6次峰面积与提取5次无明显变化，因此，将乙酸乙酯振摇提取次数定为5次。
同时，我们比较了在乙酸乙酯振摇提取次数为5次的情况下，每次振摇提取时加乙酸乙酯量对峰面积大小的影响，提取5次(40、40、40、30、20ml)和提取5次(40、40、40、40、40ml) 峰面积无明显变化；因此，将乙酸乙酯振摇提取定为5次(40、40、40、30、20ml)。
2.2.5 线性关系的考察
分别精密吸取丹酚酸B对照品溶液(C=0.132mg/ml)2、4、6、8、10、12μl分别进样，记录色谱图，测定各峰面积。以峰面积积分值为纵坐标(Y)，进样量为横坐标(X)，求得回归方程Y=14949.64X+44.61，r=0.9998。说明丹酚酸B在0.264～1.584g范围内，进样量与丹酚酸B峰面积积分值呈良好的线性关系。
2.2.6 专属性试验
参照痛经灵颗粒制备工艺制得缺丹参药材的阴性样品，同本篇所述的样品方法处理，得丹酚酸B阴性供试品溶液，按照本篇所述丹酚酸B含量测定方法进行测定，在与丹酚酸B对照品溶液对应的保留时间处，丹酚酸B阴性供试品溶液无吸收峰，表明阴性无干扰，专属性强。见图5。
A
B
C
A.阴性对照 B.供试品 C.对照品
图5 丹酚酸B含量测定HPLC
2.2.7 稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液各10μl，按本篇〔样品测定〕项下方法操作，按0、2、4、6、8h时间间隔分别进样，测定色谱峰面积，测得峰面积积分值，丹酚酸B峰面积值的RSD值为0.37%，试验结果表明，样品供试液在8小时内稳定性良好。
2.2.8 精密度试验
取同一供试品溶液，分别精密吸取10μl，连续进样5次，测定谱峰面积，丹酚酸B峰面积值的RSD值为0.88%，试验结果表明，精密度良好。
2.2.9 重复性试验
取同一批号样品(批号20060101)五份，按供试品溶液制备方法制备，分别按本篇[含量测定]项下方法操作，进样量为10μl，测定峰面积值并计算含量，RSD值为1.12%，试验结果表明，重复性良好。
2.2.10 回收率试验
取样品(批号20060101)约1.5g，精密称定，加水分别为35、25、15ml使之溶解，分别精密加入丹酚酸B对照品溶液(C=0.126mg/ml )15、25、35ml，平行做两份，其它步骤按供试品溶液制备方法制备，按本篇[含量测定]方法操作，进样量为10μl，以下列公式计算回收率，测定结果见表1。
试验结果表明：回收率在96.2%～103.1%之间，加样回收良好。
2.2.11 样品测定
取本品三批中试样品和十批小试样品各约3g，精密称定，按供试品溶液制备方法制得供试品溶液，按本篇[含量测定]方法操作，每次进样量为10μl，测定结果见表2和表3。
3 讨论
(1)对本品的薄层色谱鉴别均作了阴性对照试验，阴性无干扰，结果表明此法简单、灵敏度高、重现性好、专属性强，可作为本品定性鉴别的依据。
(2)丹参为方中君药，它的主要化瘀止痛有效成分为丹酚酸B，经过药味和含量测定方法筛选，我们选择丹参中的有效成分丹酚酸B作为含量控制项目，进行含量测定，此法具有分离效果好、灵敏、准确等优点。
(3)在痛经灵颗粒中试生产中，我们投料用的丹参药材丹酚酸B含量为3.2%，根据三批中试和10批小试样品测定结果，痛经灵颗粒丹参含量以丹酚酸B计为2.112mg/g左右。按此平均含量下浮20%计算，痛经灵颗粒成品每克含丹参量以丹酚酸B计应为1.69mg/g左右；同时，考虑到药材的来源，以及制剂生产过程、贮藏等因素影响，故暂定本品每克含丹参量以丹酚酸B(C36H30O16)计，不得少于1.4mg，且每袋装25g，故暂定本品每袋含丹参量以丹酚酸B(C36H30O16)计，不得少于35.0mg。
参考文献：
[1] WS3-B-3008-98.卫生部部颁药品标准(第15册)[S].
[2] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典(一部)[M].北京：化学工业出版社，2000.
[3] 谢秀琼主编.中药新制剂开发与应用(第二版)[M].北京：人民卫生出版社，2003.
(责任编辑：陈涌涛)
