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【摘要】 目的 研究抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)对大鼠慢性支气管炎（CB，chronic bronohitis）与肺气肿形成的影响。方法 24只健康雄性Wistar大鼠用完全随机设计随机分为4组，A组(假吸烟组)(n=6)、B组(慢性支气管炎并肺气肿组)(n=6)、C组(NAC预防组)(n=6)、D组(NAC治疗组)(n=6)，B、C及D组采用两次气管内注入脂多糖(LPS)及烟熏4周法制备慢性支气管炎并肺气肿大鼠模型，C组均在烟熏及气管内注入脂多糖前每天给予NAC(50 mg/只)灌胃，D组在第15~28天烟熏前每天给予NAC(50 mg/只)灌胃。各组对肺组织行HE染色观察肺泡面积改变。结果 B组小气道均存在纤毛损伤、上皮细胞变性坏死糜烂脱落、黏液杯状细胞增生、气道管壁黏膜充血水肿、管壁炎性细胞浸润(淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞)(P0．05)，说明C组肺气肿不明显,与A组比较D组大鼠仍有一定程度的肺气肿(P0．05).group D with the treatment of NAC had emphysema to some extentConclusion NAC can attenuate the inflammation and injury in small airways of chronic bronchitis and emphysema in rats induced by smoking and LPS.At the same time NAC can prevent the formation of emphysema in rats induced by smoking and LPS.
【Key words】N-acetylcysteine; Rat; Chronic; Bronchitis; Emphysema
吸烟是慢性阻塞性肺病(COPD)的主要致病原因，香烟烟雾中含有多种氧自由基并同时由吸烟引起肺部的异常炎性反应而释放出大量的活性氧(ROS)，氧化与抗氧化作用失衡在COPD发病中起重要作用[1,2]，徐凌等[3]报道烟雾暴露2．5个月建立大鼠COPD模型后予N-乙酰半胱氨酸(NAC)治疗对大鼠肺气肿无影响。本实验通过预防性给大鼠NAC干预及早期给大鼠NAC干预观察大鼠肺气肿改变情况以了解抗氧化剂对吸烟及脂多糖诱导的大鼠慢性支气管炎并肺气肿形成的影响。
1 材料与方法
1．1 材料 健康雄性Wistar大鼠［体质量为(230±20)g］:广西医科大学动物实验中心提供；脂多糖(LPS):购自美国Sigma公司，用蒸馏水配成浓度为200 μg/200 μl溶液；刘三姐烤烟型香烟:南宁卷烟厂制造，焦油含量:15 mg,烟碱含量:1．1 mg；医用无水氯化钙及钠石灰；N-乙酰半胱氨酸(NAC):购自美国Sigma公司,用双蒸馏水配成浓度为50 mg/ml溶液(每2 d配1次,每次给大鼠灌胃后均放在4℃冰箱保存)；自制0．22 m3玻璃箱(1．0 m×0．55 m×0．40 m)；AB204-E分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司生产):广西医科大学实验中心提供；YHL-1智能测氧仪:购自中国航天科技集团公司第七零三研究所；快速血气分析仪:Rapid point 400(德国Bayer公司生产)；奥林巴斯光学显微镜(产自日本)及Leica Qwin病理图象分析软件(产自德国):由广西医科大学实验中心提供。
1．2 方法
1．2．1 制备实验动物模型 参照钟小宁及李红梅的方法建立动物模型[4，5]，SPF级健康雄性体质量(230±20)g Wistar大鼠24只(鼠龄3个月)，进行完全随机设计随机分为四组，第一组作为假吸烟组(A组)，第二组为慢性支气管炎并肺气肿组(B组)，第三组为NAC预防组(C组)，第四组为NAC治疗组(D组)。4组大鼠均用相同的饲料及水喂养(由广西医科大学动物实验中心提供)。A组(假吸烟组):n=6,将Wistar大鼠在第1、14天经Wistar大鼠气道内注入0．9%生理盐水(NS)0．2 ml,在气道内注入0．9%生理盐水前1 d用0．9%生理盐水给大鼠灌胃(1 ml/只),第2~13天及第15~28天放入自制0．22 m3玻璃箱内，每天2 h，且每天在放入箱前用0．9%生理盐水给大鼠灌胃(1 ml/只)；玻璃箱有一小孔与外界相通，保证常压状态，箱内放置无水氯化钙及钠石灰吸收水分和二氧化碳，测氧仪监测氧浓度使氧浓度稳定在21%；大鼠可自由进食、饮水。B组(慢性支气管炎并肺气肿组):n=6,第1、14天经Wistar大鼠气道内注入LPS溶液0．2 ml,在气道内注入LPS溶液前1 d用0．9%生理盐水给大鼠灌胃(1 ml/只),第2~13天及第15~28天每天在与A组条件相同的玻璃箱内烟熏2 h(每次5支，30 min/次)；且每天在烟熏前用0．9%生理盐水1 ml给大鼠灌胃(1 ml/只)。C组(NAC预防组):n=6,在气道内注入LPS溶液前1 d用NAC给大鼠灌胃，每只50 mg[9](用双蒸馏水稀释成1 ml溶液)，第2~13天及第15~28天每天在烟熏前NAC给大鼠灌胃(每只50 mg)；气道内注入LPS溶液及烟熏方法与B组相同。D组(NAC治疗组):n=6,在气道内注入LPS溶液前1 d用0．9%生理盐水给大鼠灌胃(1 ml/只),第2~13天每天在烟熏前用0．9%生理盐水给大鼠灌胃(1 ml/只)，在第15~28天每天在烟熏前NAC给大鼠灌胃(每只50 mg)，气道内注入LPS溶液及烟熏方法与B组相同。
1．2．2 肺组织的病理组织学标本制备 右肺下叶以10%中性甲醛固定24 h,右下叶距肺门约3 mm处取材,连续切片行HE染色。
1．2．3 病理组织学评价指标及方法
1．2．3．1 气道炎症病变的观察指标及评分方法 根据Cosio等[6]设计的小气道病变评估方法和标准加以改进观察，每只大鼠任选5条直径在700~1 200 μm(管腔最短径/最长径≥0．7)的膜性细支气管，按表1观察小气道改变，取其平均值。气道炎症病变的观察指标及评分方法:观察小气道炎症包括以下各项指标:纤毛倒伏粘连缺失、上皮细胞糜烂脱落、杯状细胞增生、管壁中性粒细胞浸润、管壁淋巴细胞浸润及淋巴滤泡形成、管壁单核巨噬细胞浸润、管壁黏膜充血水肿。对各组大鼠按上述各项指标分别评分，无病变者为0级，将轻度、中度、重度异常分别评为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级。
1．2．3．2 肺气肿评分 用Rubio等[7]介绍的方法测定平均内衬间隔(MLI)和平均肺泡面积(AIA):每只大鼠至少取3个切片,在200倍镜下,苏木精-伊红(HE)切片沿最大横径和纵径任取10个视野(避开大血管和支气管),在每个视野正中心划十字交叉线,计算与交叉线相交的肺泡间隔数(NS)和每个视场面积(Sa，275 941．9 μm2)内肺泡数目(Na),同时测出十字线总长(L)。根据MLI=L/Ns、AIA=Sa/Na,计算MLI、AIA,以反映肺泡密度及平均肺泡面积。
1．3 统计学分析 使用SPSS11．5统计软件进行数据分析，计量资料的各组数据以均值±标准差(x±s)描述，对正态分布的计量资料进行参数检验。对计数资料进行非参数检验(具体方法在结果中说明)，P0．05),见表2。
2．2 肺组织病理学改变
2．2．1 小气道病理学改变分析 按照表1的各项观测指标对各个实验组的小气道进行病理形态分析，具体结果见表3。根据资料选用非参数检验(秩和检验)，从表3及检验结果显示出，与A组比较B组的小气道均存在纤毛损伤、上皮细胞变性坏死糜烂脱落、黏液杯状细胞增生、气道管壁黏膜充血水肿、管壁炎性细胞浸润(淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞)(P0．05)。(见图1-4)。
2．2．2 肺气肿分析 通过光学显微镜观察各个大鼠的HE染色肺组织切片，可见B组肺气肿明显，而C组及D组肺气肿不明显(见图4-6)。通过200倍光学纤维镜下观察及计算所得结果(见表4，采用单因素方差分析及LSD多重比较)，B组平均肺泡面积及平均内衬间隔比A组增大(P0．05)，说明C组无明显肺气肿形成,D组平均肺泡面积及平均内衬间隔比A组增大(P[8]报道是一致的。此外，与钟小宁等[9]研究用红霉素抑制中性粒细胞仅是减轻肺气肿也是相符合的；表明慢性支气管炎并肺气肿的形成与大鼠抗氧化能力降低有关，且NAC是通过抑制炎性反应而防治肺气肿。氧化与抗氧化作用失衡在COPD发病中起重要作用，来自烟雾及慢性炎症过程中的活性氧(ROS)可通过活化有丝分裂活化蛋白激酶(MAPK)、核转录因子-КB(NF-КB)及蛋白-1(AP-1)启动和/或促进慢性炎症过程，激活中性粒细胞释放中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)及激活巨噬细胞释放金属蛋白酶(MMPs)进而破坏肺实质，此外活化T淋巴细胞诱导肺泡上皮细胞凋亡[1,2]。徐凌等报道[2]烟雾暴露2．5个月建立大鼠COPD模型后予N-乙酰半胱氨酸(NAC)治疗对大鼠炎症及肺气肿无改变，这可能与氧化应激长时间作用使分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)失活及损伤组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)，从而致使SLPI抗NE等丝氨酸蛋白酶及抗炎的作用受到损害，HDAC抑制NF-КB等炎症因子转录的作用也被减弱[1,8，10]。本实验及Rubio等[8]实验均在给予促使大鼠肺气肿形成因素前予NAC干预能防治肺气肿形成可能正是NAC拮抗氧化应激对SLPI及HDAC损害并抑制氧化对炎症的扩大和对肺泡上皮细胞保护作用有关，这些有待进一步的研究。
通过本实验表明:吸烟及脂多糖诱导大鼠肺气肿形成与抗氧化能力降低有关，NAC抗氧化可抑制由吸烟及脂多糖诱导的大鼠慢性支气管炎并肺气肿的小气道炎症、拮抗小气道损伤及防治肺气肿形成。
参考文献
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4 钟小宁，白晶，施焕中,等.慢性支气管炎与肺气肿大鼠气道炎症与重塑的实验研究.中华结核和呼吸杂志，2003,26:750-755.
5 李红梅,崔德健,佟欣,等.N-乙酰半胱氨酸等对基质金属蛋白酶在大鼠慢性阻塞性肺疾病模型气道细胞外基质重塑中的作用.解放军医学杂志,2002,27:593-596.
6 Cosio M,Chezzo H,Hogg JC,et al.The relations between structural changes in small airways and pulmonary function tests.N Engl J Med,1978,298:1277-1281.
7 Rubio ML,Martin-Mosquero MC,Ortega M,et al.Oral N-acetylcysteine attenuates elastase-induced pulmonary emphysema in rats.CHEST,2004,125:1500-1506.
8 钟小宁,白晶,梁国容,等.慢性支气管炎与肺气肿大鼠气道炎症的实验研究.中国呼吸与危重监护杂志，2003,2:27-30.
9 Marwick JA,Kirkham PA,Stevenson CS,et al.Cigarette smoke alters chromatin remodeling and induces proinflammatory genes in rat lungs.Am J Respir Cell Mol Biol,2004,31:633-642.
