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[摘要] 目的 观察骨髓间充质干细胞诱导异种胰岛细胞移植的免疫耐受作用。方法 4周龄SD大鼠作为供体,密度梯度离心法分离间充质干细胞,胶原酶消化法分离胰岛细胞,链脲佐菌素制备糖尿病模型BALB/C小鼠25只。将成模小鼠分为:A组(胰岛细胞联合骨髓间充质干细胞移植组)10只,B组(单纯胰岛细胞移植组)10只,均经门静脉注射途径注入肝脏,C组(对照组)5只,仅经门静脉注入等量生理盐水,比较各组血糖改善情况。结果 两实验组均较对照组有显著差异,其中胰岛细胞联合间充质干细胞移植组效果优于单纯胰岛细胞移植组。结论 骨髓间充质干细胞可以诱导小鼠对大鼠胰岛细胞的免疫耐受,延长胰岛细胞移植物的存活时间。
[关键词] 胰岛细胞移植; 间充质干细胞; 糖尿病
[中图分类号] R392.33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)03-05-03
Combination Transplantation of Rat Islet Cells and Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Diabetic Mouse
JIA Chenle1 SHANG Zhonghua2 ZHANG Xiaoliang1 WANG Mancang1
1.Department of General Surgery,the Second Clinical Medical College of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;2.The Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China
[Abstract] ObjectiveTo observe the immune tolerance of bone marrow mesenchymal stem cells induced xenogenic islet cell transplantation. MethodsWe used 4-week-old SD rats as donors,the centrifugation of mesenchymal stem cells was performed by using density gradient,the separation of islet cells by collagenase digestion,and the preparation of of 25 STZ-diabetic model BALB/C mice with Streptozotocin. The model mice were divided into three groups:group A(combination transplantation of rat islet cells and bone marrow mesenchymal stem cells in10 mice),group B(islet cell transplantation by the portal vein injection into the liver channel in 10 mice)and Group C(control group,normal saline by portal vein injection in 5 mice. The blood glucose improvement in each group was compared. ResultsGroups A and B showed a significant difference compared with Group C,with the effect of Group A superior to that of Group B. ConclusionBone marrow mesenchymal stem cells can induce the immune tolerance of the mice to the rat islet cells and extend the survival time of islet cell graft.
[Key words]Islet cell transplantation; Mesenchymal stem cells; Diabetes
胰岛B细胞替代治疗是糖尿病治疗的理想状态。目前,胰腺移植供体缺乏,操作复杂,费用昂贵,难以广泛开展;胰岛细胞移植并发症少,技术简单,经济安全,易推广,但就完全脱离胰岛素而言,效果尚不如意,而且需要多个供体为一个受体提供细胞,供体的缺乏更加突出。目前,移植排斥反应仍然是胰岛移植无法逾越的障碍,绝大多数胰岛细胞在移植后的数小时内就被破坏殆尽,一年不依赖胰岛素率仅为8%。2000年,加拿大Shapiro等采用Edmonton方案取得连续7例胰岛移植的成功,患者不依赖胰岛素治疗时间长达17个月,被认为是胰岛移植发展史上的里程碑。2006年,Shapiro等总结了严格以Edmonton方案为基础的临床胰岛移植,结果发现,仅有58%的患者取得胰岛移植成功,然而,长期随访观察却发现2年胰岛素不依赖率降至31%[1,2]。BMSCs不表达MHCII类分子,不表达或低表达MHCI类分子,异种移植也不会产生免疫排斥反应,而且具有很强的免疫抑制作用。本实验以BMSCs联合胰岛细胞移植,评价BMSCs对移植胰岛细胞的保护作用。
1 材料与方法
1.1 动物及试剂准备
动物:6～8周龄SPF级BALB/C小鼠30只,4周龄SPF级SD大鼠20只,河北医科大学实验动物中心提供。试剂:L-DMEM培养基(Gibco公司)、红细胞裂解液、链脲佐菌素、Ficoll(Sigma公司)、胶原酶V(美国Roche公司)、全自动血糖仪(天津九安),PBS液(自制)。仪器:超净工作台BCM-1000A(国产),CO2恒温细胞培养箱(日本SANOY),低速离心机(北京医用离心机厂),相差倒置光学显微镜(Olympus)。
1.2 方法
1.2.1 BMSCs的分离 扩增4周龄SD雄性大鼠,无菌条件下取出其股骨和胫骨,以L-DMEM冲出骨髓,制成单细胞悬液,缓慢加入到密度为1.077g/mL的percoll液中,体积比为1∶1,400g离心10min,离心后液体由上至下依次为:稀释液层、富含有核细胞的白膜层、分离液层及管底的红细胞层,吸取中间的白膜层,再用PBS液冲洗两次,接种于含L-DMEM完全培养基中,置于37℃,5%CO2饱和湿度孵箱培养,次日与胰岛细胞混合移植。
1.2.2 大鼠胰岛细胞的分离和培养 SD大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉,消毒腹部,取正中切口,结扎胰管注入十二指肠末端处,向胆总管内注入胶原酶V浓度0.5mg/mL的Hanks液10mL,使胰腺充分膨胀,迅速摘取胰腺,置于37℃水浴中震荡5min,取出后用眼科剪剪成1mm3的碎块,加上述Hanks液2mL,移入小离心管后,37℃震荡消化5min,再用20mL 4℃的Hanks液终止消化,用Hanks液冲洗离心,去上清液,重复消化二次,消化物通过60目筛网过滤,收集滤液于10mL离心管中,静置后5min后,180g室温离心5min,弃上清,再洗涤2次。收集细胞,移入RPMI-1640完全培养液,次日移植。
1.2.3 小鼠糖尿病模型的建立和胰岛移植 BALB/C小鼠禁食过夜后腹腔注射2%链脲佐菌素180mg/kg,连续2次血糖测定超过16.15mmol/L并稳定2～3d提示造模成功。造模成功后,10%水合氯醛麻醉小鼠,取腹部正中切口,将SD供体大鼠的BMSCs和胰岛细胞悬液经门静脉移植入A组小鼠,B组小鼠仅注射胰岛细胞,C组小鼠注射生理盐水,每只大鼠收获的细胞对应一只小鼠。移植完毕后,全层缝合切口,应用抗生素预防感染。
1.2.4 移植效果的检测 分别在移植后1d,5d,15d后,由小鼠尾切口取血,用全自动血糖仪测定血糖。
1.3 统计学方法
所有数据均采用(均数±标准差)表示,用SPSS 17.0统计软件包进行统计学处理。应用方差分析SNK法,检验水准α=0.05,P
