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【摘要】目的：通过正交设计用不同的因素及不同的水平的提取方法来得到提取补阳还五汤中总黄酮的最佳工艺。方法：用正交试验的方法从乙醇的浓度，提取时间，溶剂倍量，提取次数四个不同因素，每个因素设置3个不同的水平。以总黄酮含量为考察指标，从中寻找一个最合适的提取条件。用紫外分光光度法测定总黄酮含量和纯度，从而确定总黄酮提取的最佳工艺。结果：确定补阳还五汤中总黄酮的最佳工艺条件为用70％的乙醇150ml煎煮3次，每次90min。结论：此次试验以乙醇作为提取溶剂，廉价、安全，且符合工业化生产的要求。
【关键词】补阳还五汤；总黄酮；含量测定
补阳还五汤是清代名医王清任创制的经典复方，该方由黄芪120g、当归尾6g、赤芍5g、地龙、川芎、桃仁、红花各3g组成，具有补气、活血、通络的功效，主治中风及其后遗症，其中所含的黄芪是重要的补气中药。本试验研究的是补阳还五汤的提取液。它含有多糖、黄酮类和皂苷类等多种有效成分[1]。本试验是恒温水浴提取补阳还五汤中总黄酮的工艺研究，为补阳还五汤的进一步研究和开发提供资料和依据，为补阳还五汤及其它经典复方的创新研究提供一定的参考价值。运用现代化学方法研究传统中药，建立起中药质量控制标准，研制出“安全、有效、可控、稳定”的新药。
1实验材料
1.1器材
电子天平AG135型，恒温水浴锅，旋转蒸发仪，循环水式真空泵SHZ-D（Ⅲ）型，电热恒温鼓风干燥箱DGG-9140A型，双光束紫外可见分光光度计TU-1900型，抽滤瓶等。
1.2药品与试剂
黄芪、当归、赤芍、地龙、川芎、桃仁、红花由杭州方回春堂药店提供。芦丁对照品，由浙江省食品药品检验所提供。无水乙醇：99.7%分析纯，安徽安特生物化学有限公司生产。10%NaNO2溶液，10%Al(NO3)3溶液，1mol/l的NaOH溶液，浓氨水，1%三氯化铝。
2实验方法
2.1补阳还五汤总黄酮的提取[2]
精密称取补阳还五汤药材,加70%乙醇150ml,提取2次,乙醇水浴回流提取90 min,过滤,摇匀，浓缩，挥干至浆状，剩余物用60%乙醇溶解置于50ml容量瓶中,加60%乙醇稀释至刻度,摇匀，作供试品备用。
2.2黄酮含量测定
2.2.1定性测定实验步骤[3]
2.2.1.1紫外光下呈色反应:取该样品溶液点在滤纸上,在可见光下呈灰黄色,在紫外光下呈灰褐色并有荧光斑点。
2.2.1.2浓氨水反应:取该样品溶液点在滤纸上,将滤纸在氨水上方熏15min ,立即在紫外光下观察( 254nm),呈极明显的黄褐色荧光斑点。
2.2.1.3三氯化铝反应:取样品溶液点在滤纸上,滴加1 %三氯化铝乙醇溶液,吹干。在可见光下呈灰黄色,在紫外光下呈黄色荧光斑点。
2.2.2定量测定[4]
2.2.2.1对照品溶液的制备
精密称取在105℃干燥恒重的芦丁对照品20mg于100ml容量瓶中,60%乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀,再精密量取10ml置50ml容量瓶中,60%乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀即得每1ml含无水芦丁0.040mg（40ug/ml）
2.2.2.2最大吸收波长的确定[5]
取供试品溶液1ml放入100ml容量瓶中,加入10%NaNO2溶液1ml,5min后加入10%Al(NO3)3溶液1ml,摇匀,6min后加入1mol/l的NaOH溶液5ml,用60%乙醇稀释至刻度,用紫外可见分光光度计将供试品溶液在400～600nm 处进行扫描,结果发现对照品溶液及供试品溶液在510nm 附近有最大吸收峰,实验中选择测定波长为510nm。
2.2.2.3标准曲线的绘制
精密量取对照品溶液2,3,4,5,6,7ml，分别置25ml容量瓶中加入10%NaNO2溶液1ml,5min后加入10%Al(NO3)3溶液1ml,摇匀,6min后加入1mol/l的NaOH溶液5ml,用60%乙醇稀释至刻度,摇匀,制成含芦丁3.2～11.2μg/ml的系列标准溶液。(以25ml容量瓶中加入10%NaNO2溶液1ml,5min后加入10%Al(NO3)3溶液1ml,摇匀,6min后加入1mol/l的NaOH溶液5ml,用60%乙醇稀释至刻度,摇匀作为空白),在510 nm 波长处测定其吸光度。
结果表明，芦丁在3.2～11.2μg/ml范围内符合Beer定律,吸光度与浓度呈良好的线性关系,其回归方程为:Y=0.0239X-0.01，相关系数R=0.9991。
2.2.2.4精密度试验
从对照品溶液中,量取2ml放入25ml容量瓶中,加入10%NaNO2溶液1ml,5min后加入10%Al(NO3)3溶液1ml,摇匀,6min后加入1mol/l的NaOH溶液5ml,用60%乙醇稀释至刻度,摇匀。溶液1ml,摇匀,6min后加入1mol/l的NaOH溶液5ml,用60%乙醇稀释至刻度,摇匀作为空白)测在 510nm 波长处测定其吸光度,重复六次。结果见表
精密试验结果:
结果表明，RSD% 乙醇浓度为70％,60min /次,溶剂量为150ml来提取,提取次数分别为1 次, 2 次, 3次, 4 次。再测定各水平总黄酮的吸光度为0.123，0.145，0.150，0.143，得提取3次最好。
2.3.2验证性实验
取补阳还伍汤药材按最佳工艺条件进行提取，进行验证实验结果见表。
3讨论
试验结果亦表明总黄酮的提取工艺与乙醇浓度及溶剂倍量有显著关系，所以最终确定补阳还五汤中总黄酮的提取工艺条件为A2B1C3D2，确定补阳还五汤中总黄酮的最佳工艺条件为用70％的乙醇150ml煎煮3次，每次90min。且试验证明其精密度和稳定性良好。用铝盐分光光度法测定黄酮的含量,结果准确可靠,操作简单易行，此法的关键是显色时间要把握好，一般以11min为宜。所得总黄酮是深棕色物质，为方便以后的含量测定，用60％的乙醇定容。初步测得补阳还五汤中总黄酮的含量为41.402mg/ml。提取时间的长短和恒温水浴温度的控制，实质上是体现在温度对浸提效果的影响，一方面浸提速度直接与浸提温度成正相关，另一方面温度升高，溶剂的粘度减少，也增大了浸提温度效率。但是，鉴于有效成分的热稳定性，以及温度升高时杂质溶出量也相应增大，在提取时浸提温度不能过高，同时也考虑到乙醇的沸点是78.5℃，温度过高，乙醇挥发严重，生产成本增大。因此将恒温水浴锅温度控制在80℃－85℃之间。本试验以廉价、安全的乙醇作为提取溶剂，所得样品有效成分含量高，表明该方法简便、实用、经济。为补阳还五汤的进一步研究和开发提供资料和依据，为补阳还五汤及其它经典复方的创新研究提供一定的参考价值。
参考文献
[1].王晚霞，李荣亨，补阳还五汤作用机制研究进展[J].中西医结合心脑血管病杂志,2008,6（5）：574～576。
[2].纪松岗,李翔,正交设计法确定黄芪中黄酮类成分的超声提取条件.第二军医大学学报，2005,26(10)：1168-1170。
[3].范媛媛，李新华，绿豆黄酮提取工艺研究[J].沈阳农业大学学报, 2005, 36(5): 619- 622。
[4].蔡碧琼,余萍，水稻谷壳中总黄酮提取工艺及其性质表征.江西农业大学学报，2007，36(5)：142-147。
[5].蔡凌云,肖娟，白�叶中黄酮成分的鉴定和含量测定.绵阳师范学院学报，2010,29（21）：78-82。
[6].李荣,胡成穆, 正交设计研究金银花总黄酮提取工艺.安徽医科大学学报，2006，41(4)：410-412。
基金项目：浙江省大学生科技创新项目（2010R410032）浙江省教育厅2010高校博士研究生创新项目
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